16S ribozomální RNA

Gen 16S rRNA se používá pro fylogenetické studie, protože je vysoce konzervován mezi různými druhy bakterií a archaea. Carl Woese (1977) propagoval toto použití 16S rRNA. To je navrhl, že 16S rRNA genu může být použit jako spolehlivý molekulární hodiny, protože 16S rRNA sekvencí z vzdáleně příbuzné bakteriální linie jsou prokázáno, že mají podobné funkce. Některé termofilní archaea (např. order Thermoproteales) obsahují 16S genové introny rRNA, které se nacházejí ve vysoce konzervovaných oblastech a mohou ovlivnit žíhání „univerzálních“ primerů., Mitochondriální a chloroplastická rRNA jsou také zesíleny.

nejběžnější pár primerů byl navržen Weisburg et al. (1991) a je v současné době označován jako 27F a 1492r; pro některé aplikace však mohou být nutné kratší amplikony, například pro sekvenování 454 s chemií titanu, primer pair 27F-534R pokrývající V1 až v3.Často se používá 8F spíše než 27F. oba primery jsou téměř totožné, ale 27F má M místo C.AGAGTTGATCMTGGCTCAG ve srovnání s 8F.,

PCR and NGS applicationsEdit

In addition to highly conserved primer binding sites, 16S rRNA gene sequences contain hypervariable regions that can provide species-specific signature sequences useful for identification of bacteria.,Výsledkem je, že sekvenování genů 16S rRNA převládá v lékařské mikrobiologii jako rychlá a levná alternativa k fenotypickým metodám identifikace bakterií. I když byl původně používán k identifikaci bakterií, 16S sekvenování bylo následně zjištěno, že být schopné klasifikovat bakterie do zcela nové druhy nebo dokonce rody.To se také používá k popisu nových druhů, které nebyly nikdy úspěšně kultivovány.,S třetí generace sekvenování přichází do mnoha laboratoří, simultánní identifikaci tisíce 16S rRNA sekvencí je možné během několika hodin, což umožňuje metagenomic studií, například střevní flóry.

Hypervariabilní regionsEdit

bakteriální 16S gen obsahuje devět hypervariabilní regiony (V1–V9), v rozmezí od asi 30 do 100 párů bází dlouhé, které se podílejí na sekundární strukturu malé ribozomální podjednotky., Stupeň ochrany se výrazně liší mezi jednotlivými hypervariabilní regiony, s více konzervovaným regionům korelace na vyšší úrovni taxonomie a méně konzervovaným regionům na nižších úrovních, jako jsou rod a druh. Zatímco celá sekvence 16S umožňuje srovnání všech hypervariabilní regiony, na přibližně 1500 párů bází dlouhé to může být příliš drahé pro studie se snaží identifikovat nebo charakterizovat různé bakteriální komunity., Tyto studie často využívají platformy Illumina, která vyrábí čte při rychlostech 50-krát a 12.000-krát levnější než 454 pyrosequencing a Sanger sekvenování, resp. Zatímco levnější a umožňuje hlubší společenství pokrytí, Illumina sekvenování vyrábí pouze čte 75-250 párů bází dlouhý (až 300 párů bází s Illumina MiSeq), a má žádný protokol pro spolehlivé montáži plnou genu ve společenství vzorků. Plné hypervariable regiony mohou být sestaveny z jediného Illumina běhu, nicméně, což je ideální cíle pro platformu.,

zatímco hypervariabilní oblasti 16S se mohou mezi bakteriemi dramaticky lišit, Gen 16S jako celek udržuje větší délku homogenity než jeho eukaryotický protějšek (ribozomální RNA 18s), což může usnadnit zarovnání. Navíc, 16S gen obsahuje vysoce konzervovanou sekvencí mezi hypervariabilní regiony, které umožňují návrh univerzálních primerů, které mohou spolehlivě produkovat stejné úseky 16S sekvence napříč různými taxony. Ačkoli žádná hypervariabilní oblast nemůže přesně klasifikovat všechny bakterie z domény na druh, někteří mohou spolehlivě předpovědět specifické taxonomické úrovně., Mnoho komunitních studií vybírá z tohoto důvodu částečně konzervované hypervariabilní oblasti, jako je v4, protože může poskytnout rozlišení na úrovni kmene stejně přesně jako plný Gen 16S. Zatímco méně konzervované oblasti se snaží klasifikovat nové druhy, když není známa taxonomie vyššího řádu, často se používají k detekci přítomnosti specifických patogenů. V jedné studii Chakravorty et al. v roce 2007 autoři charakterizovali oblasti v1–V8 různých patogenů, aby zjistili, které hypervariabilní oblasti by byly nejužitečnější pro zahrnutí pro specifické a široké testy., Mezi další zjištění, všimli si, že V3 regionu byl nejlepší v určování rodu u všech testovaných patogenů, a že V6 byl nejpřesnější při rozlišování druhů mezi všemi CDC-sledoval testovaných patogenů, včetně antraxu.

zatímco 16S hypervariable region analysis je mocným nástrojem pro bakteriální taxonomické studie, snaží se rozlišovat mezi úzce souvisejícími druhy. V rodinách Enterobacteriaceae, Clostridiaceae a Peptostreptococcaceae mohou druhy sdílet až 99% sekvenční podobnost v celém genu 16S., V důsledku toho se sekvence v4 mohou lišit pouze o několik nukleotidů, takže referenční databáze nemohou spolehlivě klasifikovat tyto bakterie na nižších taxonomických úrovních. Omezením analýzy 16S vyberte hypervariabilní regiony, tyto studie mohou selhat pozorovat rozdíly v blízce příbuzné taxony a skupiny je do jedné taxonomické jednotky, tedy podcenění celkové rozmanitosti vzorku. Kromě toho, bakteriální genomy může pojmout více 16S genů, s V1, V2 a V6 oblastí, které obsahují největší vnitrodruhové rozmanitosti., I když to není nejpřesnější metoda klasifikace bakteriálních druhů, analýza hypervariabilních oblastí zůstává jedním z nejužitečnějších nástrojů dostupných pro studie bakteriální komunity.