Diferenciální migrace holo – a apo-metalloproteins tím, MIKROFONY-BN-PAGE
Zatímco žádná separace holo- (Fe2-transferin (Tf)) a apo-Tf byl zaznamenán v konvenční 1D nativní (CBB G-250 zdarma)-PAGE (Obr. 1a) a SDS-strana (obr., 1B) je zajímavé, že jsme zjistili, že holo-a apo-TF jsou zcela odděleny pomocí mikrofonů-BN-PAGE(obr. 1c) (je třeba poznamenat, že pro „čistý“ vzorek apo-Tf byly pozorovány dvě pásma pomocí režimu BN-PAGE bez mikrofonu v důsledku kontaminace kovovými ionty; Doplňkový obr. S1). V SDS-PAGE je to pravděpodobně způsobeno disociací kovových iontů z holo-forem, které se vyskytují za silných denaturačních podmínek14 ,15 (data nejsou zobrazena). Tato skutečnost naznačuje, že elektroforetické rozpoznávání mezi Holo-a apo-formami není k dispozici pro konvenční metody stránky., Tyto výsledky naznačují, že specifické slabé denaturačními přísadami, jako CBB G 250 zaměstnaných v MIKROFONY-BN-PAGE, rozpoznat rozdíl mezi holo – a apo-metalloproteins k posílení oddělení, kromě vyhnout se kovové disociace.
Různé migrační chování pro holo – a apo-formy byly pozorovány také pro ceruloplasmin (Cp) vázán s Cu2+ (Cu-Cp) a superoxiddismutázy (SOD), která je vázána s Cu2+ a Zn2+ (Cu/Zn-SOD) MIKROFONY-BN-PAGE metoda (Obr. 1d, e). Apo-formy migrovaly na pozice v úzké korespondenci s jejich přesnými molekulárními váhami v mikrofonech-BN-PAGE (obr., 1: Tf, 77 kDa; Cp, 134 kDa; SOD, 32 kDa), což je užitečné při identifikaci proteinů. Jak je popsáno v úvodní části, tato zjištění nás vedla k vývoji metodiky holo/apo conversion (HAC)-2D MICS-BN-PAGE pro selektivní izolaci holo-metaloproteinů.
Koncept holo/apo konverze 2D MIKROFONY-BN-PAGE
Naše nové 2D STRÁNKA metodu založenou na diferenciální migrace mezi holo – a apo-metalloproteins, začíná s MIKROFONY-BN-PAGE fázi vedena ve dvou jízdních pruhů (pruhy a a B v Obr., 2, panel I) umožňující oddělení holo – a apo-metaloproteinů od vzorku obsahujícího obě metaloproteinové formy. Oba pruhy jsou poté podrobeny dvěma různým ošetřením po počátečním oddělení mikrofonů-BN-PAGE: pruh a je podroben druhé fázi mikrofonů-BN-PAGE,ale pouze po provedení konverze holo / apo (obr. 2 panel II-1) ; zatímco pruh B je dodáván do fáze detekce kovů, aby se určily kovové ionty spojené s oddělenými proteiny(obr. 2 panel II-2). Léčba aplikovaná na Lane B byla dříve validována., Například stanovení některých iontů těžkých kovů (Cu2+, Fe3+, Co3+, Ni2+, Mn2+ a Cd2+) na malý objem (µL) vzorky v ppt a sub-ppb úrovně tím, že tato STRÁNKA metodu bez použití čisté místnosti byly reported21. Navíc, tento tandem 1D MIKROFONY-BN-PAGE/detekce kovů STRÁNCE metodiky odhalil přesné rozdělení Cu2+ v lidském séru i pro slabě albumin-bound (vyměnitelné) Cu2+ 21, a navrhl, že periplasmic Rubrivivax gelatinosus úbytek biodiverzity bílkovin vysoce zapojený v mědi odpor měď-závazné protein22., Přesto je úplná identifikace proteinů vázaných na kov v komplexním vzorku bílkovin obtížná kvůli koemigračním proteinům. Například, to nebylo plně prokázáno, že úbytek biodiverzity je copper-binding protein v R. gelatinosus, i když jeho sekvence má tři domnělé Cu-vazebná místa: (i) 1. typu copper center přítomen v mnoha cupredoxins jako azurin a plastocyanin, (ii) Histidin-rich N-konci sekvence a (iii) Histidin/Methionin-bohaté sekvence. Proteiny související s CopI jsou přítomny v mnoha bakteriích, ale nejsou široce konzervovány; například v Escherichia coli22 chybí., Dosud byly studovány pouze proteiny R.gelatinosus a Vibrio cholerae a podílejí se na rezistenci Cu22,23. V r. gelatinosus je protein CopI vysoce exprimován v přítomnosti Cu2+; mechanismus detoxikace Cu je však stále neznámý. Proto je nutná metoda izolace metaloproteinů ze všech ostatních proteinů, které existují v komplexních biologických vzorcích.
Pojem HAC-2D MIKROFONY-BN-PAGE/detekce kovů STRÁNCE metodiky., Panel I: 1D mikrofony-BN-strana ve dvou pruzích. Lane byl vystaven v-gel holo/apo konverze postup (jako v Panelu II-1), a pak Pruhu byl podroben 2D MIKROFONY-BN-PAGE po holo/apo konverzi (jako v Panel III). Pruh B byl podroben detekční stránce Cu2+ a Fe3+ (jako v panelu II-2). 2D elektroforeogramu je pro směs metalloproteins (holo-Tf, apo-Tf, holo-Cp a holo-SOD), ve kterém holo-metalloproteins v původním vzorku byly izolovány jako skvrny z diagonální čáry (tečkovaná žlutá čára v Panel III). Verze elektroferogramů v plné velikosti znázorněné na obr., 2 jsou znázorněny na obr. S2.
K překonání tohoto omezení, informace poskytnuté 1D MIKROFONY-BN-PAGE/detekce kovů analýza STRÁNKA Lane B je rozšířená o podrobení jízdního Pruhu do druhého rozměru MIKROFONY-BN-PAGE po holo/apo konverze. Pro provedení této analýzy je pruh a nejprve namočen v kyselém roztoku chelátoru kovů (viz část metody a doplňující podrobné podmínky)pro konverzi holo / apo (obr. 2 panel II-1)., Holo-metaloproteiny jsou přitom derivatizovány na apo-metaloproteiny bez kovu v gelu první dimenze stránky. Ošetřený pruh a je pak dodáván do druhé fáze mikrofonů-BN-PAGE pomocí agarózového gelu bez kovu (viz doplňující informace). Ve druhém mikrofonu-BN-stage (obr. 2, panel III), apo-metalloproteins a non-metalloproteins z původního vzorku migrovat na diagonální linii, protože migrace těchto druhů ve druhé dimenze STRÁNKA je zcela totožný s jejich migrace na první STRÁNCE dimenze., Na druhou stranu, holo-metalloproteins z původního vzorku migrovat různé vzdálenosti v prvním a druhém MIKROFONY-BN-PAGE rozměry, protože tyto proteiny migrovat jako jejich holo-formy v prvním rozměru a jako jejich apo-formy v druhé dimenzi (a protože MIKROFONY-BN-PAGE za následek různé elektroforetické mobility pro holo – a apo-formy metalloproteins; vide infra). Takže pouze holo-metaloproteiny z původního vzorku migrují z diagonální linie ve druhé dimenzi, které mají být identifikovány MALDI-TOF MS bez dalšího čištění bílkovin., Typy a množství kovových iontů vázaných metaloproteiny v původním roztoku vzorku (ty izolované jako off-diagonální skvrny), mohou být určeny detekční stránkou kovu pruhu B, jak je popsáno výše. Proto informace týkající se identifikace a rozdělení metalloprotein druhů, spolu s totožností a koncentrace kovových iontů vážou, je přístupný z této nové HAC-2D MIKROFONY-BN-PAGE/detekce kovů STRÁNCE metodiky.,
Selektivní izolace metalloproteins v HAC-2D MIKROFONY-BN-PAGE
Pro proof-of-concept, HAC-2D MIKROFONY-BN-PAGE/detekce kovů STRÁNKA byla prokázána u vzorku směsi obsahující holo-Tf, apo-Tf, holo-Cp a holo-SOD protein standards (což v 2D elektroforeogramu z Obr. 2, panel III) a také pro vzorek lidského séra(Doplňkový obr. Galaxie). Pro smíšený vzorek bílkovin byly úspěšně pozorovány skvrny holo-metaloproteinů, které migrovaly z diagonální linie., Kromě toho byl Fe3+ detekován na pozici holo-Tf a Cu2 + na pozicích holo-Cp a holo-SOD, v první fázi mikrofonu-BN pomocí stránky detekce kovů. Pokud není provedena žádná konverze holo / apo, všechny proteiny migrují na diagonální linii(Doplňkový obr. S5). U vzorku lidského séra byly úspěšně detekovány holo-Tf a holo-CP (Doplňkový obr. Galaxie)., Byl tedy učiněn závěr, že stránka detekce HAC-2D mikrofonů-BN-PAGE/metal je velmi účinná pro izolaci holo-metaloproteinů a identifikaci iontů kovů původně vázaných na metaloproteiny v proteinové směsi.
a Konečně, HAC-2D MIKROFONY-BN-PAGE byla použita metoda k celkové bakteriální rozpustné proteinové frakce získané z R. gelatinosus buňky pěstované v přítomnosti 1,2 mM Cu2+, vyjadřující úbytek biodiverzity bílkovin. To představuje vzorek biologického proteinu., U tohoto vzorku bylo na první a druhé straně nalezeno místo mimo diagonální čáru v poloze 100 kDa a 29 kDa (obr. 3a). Vysoká koncentrace Cu2 + byla pozorována v poloze 97-139 kDa v prvních mikrofonech-BN-PAGE(obr. 3b). V důsledku toho se dospělo k závěru, že protein v tomto místě má cu ion vázaný na něj. Místo bylo vyříznuto a následně analyzováno MALDI-TOF MS. peptidy odpovídající CopI byly identifikovány (obr. 3c, Doplňkový Obr. S7 a tabulka S1)., Kromě toho, když byla tato gelová skvrna spuštěna na SDS-PAGE, bylo pozorováno jediné pásmo proteinu CopI (data nejsou zobrazena). Další místo mimo diagonální čáru bylo pozorováno na přibližně 40 kDa (nad 29 kDa CopI spot ve druhé dimenzi(obr. 3a)). To bylo potvrzeno MALDI-TOF MS, že toto místo také pochází z CopI (a byl pravděpodobně dimer CopI podle molekulové hmotnosti). Metaloprotein by tedy mohl být specificky izolován ze složité proteinové směsi a zároveň identifikovat jeho vázaný kov., Tato analýza podle HAC-2D MIKROFONY-BN-PAGE rozhodně dokázal, že úbytek biodiverzity je měď binding-protein, a je zajímavé, že tento majetek by mohl být v souvislosti s protein je Cu-detoxikační funkce v bakteriální periplasm. Další kvantitativní analýza odhalila stechiometrie Cu iontů úbytek biodiverzity jako 1:1 (na základě koncentrace vázané Cu ion (1.05 µM) a holo-úbytek biodiverzity bílkovin (0.95 µM), jak určí CBB R-250 staining). To je v naprosté shodě s dalšími experimentálními výsledky, které našly Cu:CopI stechiometrie 1:1.2 pomocí ICP-MS s čistou CopI (Durand et al.,, nepublikovaná data). Tento výsledek naznačuje, že naše metoda je také užitečná pro vyšetřování metaloproteinových stechiometrií.
HAC-2D MIKROFONY-BN-PAGE zaměstnávání barvením stříbrem (a), s Cu2+ detekce STRÁNKU (b), z rozpustné frakce získané z R. gelatinosus buňky pěstované v přítomnosti 1,2 mM Cu2+ (celková bílkovina: 31.5 µg). Off-diagonální místě označeném hvězdičkou v (a) byly podrobeny MALDI-TOF MS (Doplňkový Obr., S7), identifikace sekvencí zobrazených červeným písmem jako součást sekvence CopI mature (c). Verze elektroferogramů v plné velikosti znázorněné na obr. 3 jsou znázorněny na doplňkovém obr. S8.
Kapilární elektroforéza experimenty vyšetřovat molekulární rozpoznávání režimy
rozlišení vylepšení mezi holo – a apo-formy na MIKROFONY-PAGE pomáhal s CBB barvivo (Obr., 1c–e) je důležitým klíčem k naší metodiky, a zajímavé je, že tato molekulární rozpoznávání se zdá, že pocházejí z různých čísel z CBB G-250 barvivo molekuly, vazba na každé z holo – vs. apo-formy metalloproteins. To zase pravděpodobně vede k různým účinným nábojům a / nebo indukovaným sterickým strukturám pro komplexy barviv a bílkovin. Oba tyto účinky by měly dopad na elektroforetickou mobilitu., Získat hlubší vhled, pokud jde o uznání mechanismus CBB G-250 vázání barviva směrem k holo – a apo-Tf, CE byly provedeny experimenty, spolu s dokovací simulace pomocí AutoDock Vina program24,25 (vide infra). CZE se provádí ve volném vodném roztoku bez gelové matrice, a proto se v simulacích nemusí brát v úvahu molekulární prosévací účinek. Elektroforetická mobilita holo-Tf měřená CZE byla zjevně odlišná od mobility apo-Tf s přidáním barviva CBB(obr. 4), zatímco tyto proteiny měly stejné mobility v nepřítomnosti barviva., Tato skutečnost silně naznačuje, že počet molekul barviva vázaných na holo-a apo-metaloproteiny je odlišný. V ČR by migrace komplexu proteinových barviv byla převážně ovlivněna účinným nábojem komplexu, což by bylo ovlivněno počtem jednotlivě nabitých aniontových molekul CBB barviv vázaných na protein.,
Typický electropherograms z CZE experimenty pro: 10 µM holo – nebo apo-Tf bez CBB G-250 (horní stopa); a směsi obsahující 5 mM CBB G-250 barvivo s 10 µM holo-Tf (střední modrá křivka) nebo s 10 µM apo-Tf (spodní červená stopa).,
Tradičně, elektroforetická mobilita proteinu ve volném roztoku je reprezentován Henryho rovnice, jak je uvedeno v rovnici (1):
Tady, Q, η, R a k představují čistý náboj, řešení viskozita, poloměr proteinu, a inverzní Debye délka roztoku elektrolytu. Funkce Henryho, H, SE monotónně zvyšuje z 2/3 na 1., Striktně řečeno tento vzorec platí pouze pro kulovité molekuly s centrosymmetric rozložení náboje, ačkoli tam jsou některé diskuse upravit Henryho rovnice platí pro non-kulovité proteiny s komplexní rozložení náboje (včetně dipól a kvadrupól)26. V našem případě, holo – a apo-Tf molekuly jsou deformované oblastech velmi podobné velikosti (připomínající toroidy s dlouhé a krátké osy, délky přibližně 92 a 60 Å (holo-Tf), a 93 a 68 Å (apo-Tf), respektive) (Doplňkový Obr. S9)., Navíc, dipól a kvadrupól se očekává, že mají jen malý vliv na mobilitu od CBB G-250 molekuly vázán na holo-/apo-Tf nejsou lokalizovány, jak je uvedeno v Doplňkových Obr. S9 (viz níže). Výsledky přesných výpočtů Kim et al.26 ukazují, že elektroforetická pohyblivost je globulární protein není výrazně ovlivněna kvadrupól v roztocích o nízké iontové síle (I < 0,01 M), a iontové síly separační pufr v našem CZE experimenty byl podobně nízký (I = 0.013 M).,
to Znamená, že poměr elektroforetické mobilit apo a holo-Tf komplexu s CBB G-250, barvivo (jmenovitě, µApo/µHolo), je přičítána poměr čisté poplatky z každého komplexu (konkrétně QApo/QHolo), které mohou být snadno odvozeny od Henryho rovnice. Záporné čisté náboje komplexů Tf-CBB G-250 pocházejí hlavně z vazebného čísla barviva. V důsledku toho hodnota µApo / µHolo také udává poměr čísel barviv (jmenovitě NApo/NHolo). Experimentálně je poměr elektroforetických mobilit dvou forem Tf (µApo / µHolo = (-2.69 × 10-4)/(-2.,09 × 10-4)) bylo zjištěno, že CZE je 1,29 (obr. 4), což odpovídá poměru účinného elektrického náboje, za předpokladu, že velikosti obou forem Tf jsou podobné. Poměr elektroforetických mobilit by proto měl souhlasit s poměrem vázaných molekul barviva. Další diskuse o vztahu mezi elektroforetickou mobilitou a tvarem bílkovin u jiných metaloproteinů je však nutná v případech, kdy se tvary holo – a apo-proteinů liší (jako u Cp).,
Molekulární dokování simulační experimenty vyšetřovat molekulární rozpoznávání režimy
Dye vazba byla určena flexibilní molekulární dokování simulace pomocí AutoDock Vina27, navržen tak, aby vyčerpávajícím způsobem vyhledávání pro vazebná místa a vypočítat jejich volné energie (Obr. 5 a doplňkový obr. S9). Nedávno, Wang et al.25 uvádí, že AutoDock Vina má vysokou bodování moc a střední odběr energie ve vztahu k jiným široce používané dokovací programů., Podle těchto simulací se větší počet molekul barviva CBB G-250 vázaných na volná místa vázající Fe v apo-Tf ve srovnání s holo-Tf (obr. 5A) byly pozorovány. Na základě těchto Autodock Vina simulace, poměr barvivo-závazný počet NApo/NHolo bylo zjištěno, 1.23, s vazebná energie <-6.5 kcal/mol (což odpovídá K~104.4 M−1) (Obr. 5B pro číslo vázající barvivo kumulativní frekvenční rozložení jako funkci vazebné energie), což je v dobré shodě s našimi výsledky CZE, diskutované dříve (NApo/NHolo = 1.29)., Kvantitativní vazba se předpokládá přidáním barviva na úrovni mM (více než 95% vazebných míst interaguje s barvivem, když je log K 4, 4 nebo větší), jako v těchto experimentech.
vazba počet barvivo molekuly s holo-Tf byl také vyšetřován CZE experimenty (data nejsou zobrazena), jak soudil ze snížení volného barviva peak na 1 mM CBB G-250 barvivo vzorku s a bez přídavku 10 µM holo-Tf., Od závazné číslo bylo měřeno >18, vazba počet NHolo předpokládalo, že je >20 v MIKROFONY-BN-PAGE experimenty (s 3.0 mM barvivo přidáno). Tato vazba počet barvivo molekuly (>20) z ČR experimentů je v dobré shodě s počtem vázané barvivo molekuly (N = 21) z molekulární dokování simulací, které by vedlo k předpokládané afinita -6.5 kcal/mol, a tak naše výsledky jsou self-konzistentní.,
To je vidět z těchto molekulární dokování simulace a CZE experimenty, které CBB G-250 barvivo rozeznává různé chemické struktury holo – a apo-metalloproteins na výnos různých µ hodnoty. Podrobnější vyjádření simulované závazné režimy také naznačují, že CBB G-250 molekula interaguje s aminokyselinových zbytků přístupné vzhledem k více otevřené (rozložil) apo-Tf strukturu ve srovnání s více uzavřený (složené) holo-Tf strukturu, zatímco barvivo nevykazuje žádné závazné přímo s Fe-závazné aminokyselinových zbytků (Asp392, Tyr429, Tyr517 a Jeho 585)., Předpokládá se tedy, že barvivo rozpoznává malé rozdíly mezi složenými a rozloženými chemickými strukturami metaloproteinů, které jsou indukovány vazbou nebo disociací kovových iontů. Takové malé rozdíly nelze identifikovat jinými konvenčními metodami separace.
aminokyselinové zbytky kontaktující molekulu barviva v každém místě vazby barviva v simulaci(například Doplňkový obr. S10) byly kategorizovány podle jejich dominantní povahy: hydrofobní, hydrofilní nebo elektrostatický náboj (jak je shrnuto v doplňkové tabulce S2 a tabulce S3)., Podle výsledků, populace každého druhu aminokyselin interakci s barvivem molekuly neukázaly žádný rozdíl mezi holo – a apo-protein formy (26-27% pro hydrofobní, 37-40% pro hydrofilní, 33-35% u nabitá rezidua v každé formě). Počet vodíkových vazeb v apo-Tf (celkem 33; 1, 2 na vazebné místo) byl však výrazně větší než v holo-Tf (celkem 19; 0, 9 na vazebné místo). Při zaměření na osm vazebných míst v apo-Tf, která nebyla přítomna v holo-Tf (doplňková tabulka S3), bylo zjištěno, že počet h-vazeb na místo je 2.1., Tyto výsledky silně naznačují, že změny v vodíková vazba interakce jsou primárně zodpovědné za diferenciaci mezi holo – a apo-Tf formy, zatímco další vyšetřování by bylo zapotřebí, aby se pochopit, kompletní mechanismus.