vývoj, diferenciace a růst buněk a tkání vyžadují přesně regulované vzory genové exprese. Zesilovače fungují jako cis-regulační prvky pro zprostředkování prostorové i časové kontroly vývoje zapnutím transkripce ve specifických buňkách a/nebo potlačením v jiných buňkách. Tedy konkrétní kombinace transkripčních faktorů a dalších proteinů vázajících DNA v vyvíjející se tkáni řídí, které geny budou vyjádřeny v této tkáni. Zesilovače umožňují použití stejného genu v různých procesech v prostoru a čase.,
Identifikace a characterizationEdit
Tradičně, stimulátory byly identifikovány enhancer trap techniky pomocí reporter gene, nebo pomocí srovnávací sekvenční analýzy a výpočetní genomika. V geneticky povolný modely, jako jsou ovocné mušky Drosophila melanogaster, například, reportér postavit např. lacZ genu může být náhodně integrované do genomu pomocí P prvek transposon. Pokud se reportérský Gen integruje v blízkosti zesilovače, jeho exprese bude odrážet expresní vzorec poháněný tímto zesilovačem., Barvení mušek pro expresi nebo aktivitu LacZ a klonování sekvence obklopující integrační místo umožňuje identifikaci sekvence zesilovače.
vývoj genomických a epigenomických technologií však dramaticky změnil výhled na objev cis-regulačních modulů (CRM)., Příští generace sekvenování (NGS) metody nyní umožňují vysokou propustností funkční CRM objev testy, a výrazně zvyšuje množství dostupných údajů, včetně rozsáhlých knihoven transkripční faktor-vazebné místo (TFBS) motivy, sbírky komentovaný, potvrzen Crm, a rozsáhlé epigenetických dat napříč mnoha typy buněk, jsou přesné výpočetní CRM objev dosažitelný cíl. Příklad přístupu založeného na NGS s názvem DNase-seq umožnil identifikaci nukleosomově vyčerpaných nebo otevřených chromatinových oblastí, které mohou obsahovat CRM., V poslední době byly vyvinuty techniky, jako je ATAC-seq, které vyžadují méně výchozího materiálu. Nucelosome vyčerpané regiony mohou být identifikovány in vivo prostřednictvím vyjádření Přehrady methylase, což umožňuje větší kontrolu nad mobilní-konkrétní typ enhancer identifikace.Výpočetní metody zahrnují srovnávací genomiku, shlukování známých nebo předpovídaných míst vázajících TF a kontrolované přístupy strojového učení vyškolené na známých CRM., Všechny tyto metody se ukázaly jako účinné pro CRM objev, ale každý má své vlastní úvahy a omezení, a každý z nich je předmětem na větší či menší počet falešně pozitivní identifikace.V komparativní genomika přístup, zachování sekvence non-kódování regionů, může být svědčící o stimulátory. Sekvence z více druhů jsou zarovnány, a konzervované oblasti jsou identifikovány výpočetně., Zjištěná sekvence pak může být připojen k reporter gene jako zelený fluorescenční protein, nebo lacZ pro stanovení in vivo vzor genové exprese produkovaného enhancer, když vstřikuje do embrya. vyjádření mRNA reportéra lze vizualizovat hybridizací in situ, která poskytuje přímější míru aktivity zesilovače, protože není vystavena složitostem překladu a skládání bílkovin., Ačkoli mnoho důkazů poukázalo na zachování sekvencí pro kritické vývojové zesilovače, jiná práce ukázala, že funkce zesilovačů může být zachována s malou nebo žádnou primární sekvencí. Například, ret enhancers u lidí mají velmi malou sekvenci zachování těm v zebrafish, přesto sekvence obou druhů produkují téměř identické vzory exprese reportér genu v zebrafish., Podobně, ve velmi rozcházely hmyzu (oddělené kolem 350 milionů let), podobné genové exprese vzory z několika klíčových genů bylo zjištěno, že být regulovány prostřednictvím podobně představuje Crm i když tyto jsou Takové, které nevykazují žádné znatelné zachování sekvence zjistitelný standardní sekvence zarovnání metody jako VÝBUCH.
segmentace insectsEdit
stimulátory určení počátku segmentace v Drosophila melanogaster embryí patří mezi nejlépe charakterizovat vývojové zesilovače., V raném fly embryu jsou transkripční faktory gap genu zodpovědné za aktivaci a potlačení řady segmentačních genů, jako jsou geny pravidla páru. Gap geny jsou vyjádřeny v blocích podél předozadní osy létat spolu s dalšími mateřské účinek transkripčních faktorů, čímž se vytváří zóny, ve které různé kombinace transkripční faktory jsou vyjádřeny. Dvojice-pravidlo geny jsou odděleny od sebe navzájem non-exprimující buňky. Kromě toho jsou pruhy exprese pro různé geny s dvojitým pravidlem kompenzovány několika průměry buněk od sebe navzájem., To znamená, jedinečné kombinace dvojice-pravidlo genové exprese vytvořit prostorové domény podél předozadní osy nastavit každé ze 14 jednotlivé segmenty. 480 BP enhancer zodpovědný za řízení ostrého proužku dva genu pro párové pravidlo dokonce přeskočené (eve) bylo dobře charakterizováno. Enhancer obsahuje 12 různých vazebných míst pro transkripční faktory mateřského a gap genu. Aktivace a potlačování stránek se postupně překrývají., Eva je vyjádřena pouze v úzkém proužku buněk, které obsahují vysoké koncentrace aktivátorů a nízké koncentrace repressors pro tento enhancer sekvence. Ostatní oblasti enhanceru řídí exprese Evy v dalších 6 pruzích embrya.
u obratlovců patterningEdit
stanovení tělesných OS je kritickým krokem ve vývoji zvířat. Během myší embryonální vývoj, Uzlové, transformující růstový faktor-beta nadčeleď ligand, je klíčový gen zapojený do vzorování jak anterior-posteriorní osy a levo-pravé osy z časných embryí., Nodální gen obsahuje dva zesilovače: proximální Epiblast Enhancer (PEE) a asymetrický Enhancer (ASE). MOČ je před Uzlové genu a disky Uzlové výraz v části primitivní pruh, který bude diferencovat do uzlu (také odkazoval se na jako primitivní uzel). Moč zapne uzlový výraz v reakci na kombinaci signalizace Wnt plus druhý, Neznámý signál; tedy člen rodiny transkripčního faktoru LEF / TCF se pravděpodobně váže na vazebné místo TCF v buňkách v uzlu., Šíření Uzlové od uzlu tvoří gradient, který pak vzory na prodloužení předozadní osy embrya. ASE je intronický zesilovač vázaný transkripčním faktorem domény vidlice Fox1. Na počátku vývoje vytváří uzlový výraz poháněný Fox1 viscerální endoderm. Později ve vývoji, Fox1 vazba na ASE disky Uzlové výraz na levé straně boční desky mesoderm, a tím vytvořit vlevo-vpravo asymetrie nezbytné pro asymetrický vývoj orgánů v mesoderm.,
stanovení tří zárodečných vrstev během gastrulace je dalším kritickým krokem ve vývoji zvířat. Každá ze tří zárodečných vrstev má jedinečné vzorce genové exprese, které podporují jejich diferenciaci a vývoj. Endoderm je specifikován na počátku vývoje expresí Gata4 a Gata4 pokračuje v přímé morfogenezi střev později. Exprese Gata4 je řízena v časném embryu intronickým zesilovačem, který váže další faktor transkripce domény forkhead, FoxA2., Zpočátku enhancer pohání širokou genovou expresi v celém embryu, ale exprese se rychle omezuje na endoderm, což naznačuje, že do jeho omezení mohou být zapojeny další represory. Pozdní vývoj, stejný zesilovač omezuje expresi na tkáně, které se stanou žaludkem a pankreasem. Další zesilovač je zodpovědný za udržování exprese Gata4 v endodermu během mezilehlých fází vývoje střev.,
Více zesilovačů podporovat vývojové robustnessEdit
Některé geny zapojené v kritické vývojové procesy obsahují více zesilovačů souběhu funkcí. Sekundární stimulátory, nebo „stín stimulátory“, může být nalezeno mnoho kilobází od primárního enhancer („primární“ obvykle se odkazuje na první enhancer objevil, který je často blíže k gen reguluje). Každý zesilovač sám o sobě řídí téměř identické vzorce genové exprese. Jsou tyto dva zesilovače skutečně nadbytečné?, Nedávná práce ukázala, že více zesilovačů umožňuje ovocným mouchám přežít poruchy prostředí, jako je zvýšení teploty. Když je zvýšena při zvýšené teplotě, jeden zesilovač někdy nedokáže řídit úplný vzorec exprese, zatímco přítomnost obou zesilovačů umožňuje normální genovou expresi.