Fetální bovinní sérum (FBS) je kapalná frakce, sražené krve z plodu telata, vyčerpaných buněk, fibrinu a koagulační faktory, ale obsahují velké množství výživy a makromolekulární faktory nezbytné pro růst buněk. Hovězí sérový albumin je hlavní složkou FBS. Růstové faktory v FBS jsou nezbytné pro udržení a růst kultivovaných buněk . FBS také obsahuje řadu malých molekul, jako jsou aminokyseliny, cukry, lipidy a hormony.
FBS se používá v široké škále aplikací., Jedním z primárních používá FBS je v eukaryotické buněčné kultury, s concentractions až 20%, nebo dokonce vyšší, kde poskytuje mnoho esenciálních živin a růstových faktorů, které usnadňují přežívání buněk a proliferaci. Je však důležité poznamenat, že FBS v kulturách lidských buněk může zavádět výzkumné artefakty; lidské buňky Kultivované s lidskými séra se chovají odlišně od těch kultivovaných s FBS ., FBS se také používá při výzkumu, výrobě a kontrole lidských a veterinárních vakcín a biotechnologických léčiv a používá se k zastavení trávení trypsinu nebo k ochraně při kryokonzervaci . Buněčná kultivační média bez séra se používají již mnoho let. Fetální bovinní sérum nemusí být nejlepším doplňkem buněčné kultury. Například, bovinní sérový albumin s inzulín-transferin-sodium selenite a/nebo epidermálního růstového faktoru do kultivačního média zlepšuje skotu, embryí kvality a invaze trofoblastu, ve srovnání s fetální bovinní sérum .
fetální sérum obsahuje více růstových faktorů a má nižší obsah gama globulinu (tj. Ty jsou důležité, protože růstové faktory usnadňují přežití a proliferaci buněk, zatímco protilátky se mohou vázat na buňky v kultuře. Kromě toho, fetální sérum obsahuje nižší hladiny komplementu (doplňuje) než ty z dospělých, nebo novorozenců. Tyto doplňky mají nežádoucí účinky lyzování buněk v kultuře a zasahování do imunotestů.
sérum a plazma jsou odvozeny z celé krve pomocí odstředění k odstranění složek včetně červených krvinek. Rozdíl mezi plazmou a sérem spočívá v tom, že koagulační proteiny jsou přítomny v plazmě, ale byly odstraněny ze séra. Plazma se obvykle připravuje přidáním antikoagulancií do krve před centrifugací, ale koagulační proteiny nejsou odstraněny. Sérum se připravuje tak, že nechá krev koagulovat před odstředěním nebo rozsáhlou/progresivní centrifugací. Tak fibrinogen a proteiny spojené s srážení nejsou přítomny v séru.,
U lidí, následujících 22 proteiny tvoří 99% z celkového obsahu bílkovin v séru a plazmě: albumin, celkové IgG, transferin, fibrinogen, celkové IgA, alfa-2-makroglobulin, celková IgM, alfa-1-antitrypsin, C3 komplement, haptoglobulin, alfa-1-kyselý glykoprotein, apolipoprotein-B, apolipoprotein-A1, lipoprotein (a), faktor H, ceruloplasmin, C4 komplementu, komplement faktor B, pre-albumin, C9 komplementu, C1q komplementu, a C8 doplňují . Zbývajících 1% obsahuje stovky bílkovin., Nejhojnější sérový protein, albumin, v dávce 50 mg / ml, obsahuje asi polovinu celkové hmotnosti bílkovin .
Mezinárodní asociace sérového průmyslu (ISIA; www.serumindustry.org), obchodní organizace poskytovatelů séra, zavedené pokyny pro standardizaci kontroly kvality. Tyto pokyny vyžadují, aby následující testy byly provedeny pomocí specifických metodik a výsledky testů musí být k dispozici jako osvědčení o analýze (Tabulka 1).,h>Test
bakterie a plísně – sterilita testování
mycoplasma
cytopatického agenti – testování
hemadsorbing agenti – testování
bovinní virové průjmy – testování
měření pH
osmolalita
celková bílkovina, určena Biuretova metoda,
endotoxin
hemoglobin
elektroforetické vzor,
testování výkonu, jako kmenové buněčné kultury
radiální immunodiffusion
imunoglobulin
gama-glutamyl transferázy (GGT)
Tabulka 1., Minimální požadavky na sérový test.
Endotoxiny, nazývané také lipopolysacharid (LPS) nebo lipooligosaccharide (LOS), pochází z vnější membrány Gram-negativních bakterií, a přispívá ke klinické projevy různých patogenních Gram-negativních bakterií. In vivo endotoxiny indukují horečku a zánětlivou odpověď, zatímco v buněčné kultuře zavádějí variace buněčných odpovědí.
hladiny endotoxinu se měří testem Limulus amebocyte lyzate (LAL)., Amebocyty jsou analogické s bílými krvinkami u obratlovců a LAL se připravuje z krve Limulus polyphemus (Americký krab podkovy; Obrázek 1). LAL je velmi citlivý na endotoxiny a koaguluje za přítomnosti i minutového množství endotoxinu. Stav ochrany amerického kraba podkovy byl hodnocen a diskutován v populární kultuře . Mnoho populací krabů podkovy je ohroženo, a proto je třeba dbát na jejich ochranu před ztrátou.
níže uvádíme některé z běžně používaných speciálních sér. Sérum přípravky specializované na konkrétní výzkumná témata, jako je lipoprotein s nedostatkem séra z Kalen Biomedicínské pro cholesterol výzkum , nebo pro specializované genové exprese systémy, jako je tetracyklin-screening fetálního bovinního séra , nejsou diskutovány.
Pravidelné FBS obsahuje velké množství extracelulární váčky, z nichž některé jsou exosomy ., Při provádění exosomového výzkumu s kultivovanými buňkami je důležité používat FBS bez exosomů. Je však důležité si uvědomit, že FBS vyčerpaná exosomem může ovlivnit a podporovat růst buněk jinak než běžné FBS . Exosome-ochuzený FBS může být buď zakoupit přímo z několika komerčních dodavatelů, nebo upravené buď prostřednictvím ultracentrifugation nebo ultrafiltrace, i když účinky vyčerpání procesů a/nebo komerčních zdrojů, mohou být konzistentní, pokud jde o růst buněk a fyziologie .,
ostatní složky FBS mohou být vyčerpány v závislosti na experimentálních požadavcích. Například Galmozzi a et al vyčerpaný heme z FBS s kyselinou askorbovou .
běžným ošetřením FBS je tepelná inaktivace, kde se FBS zahřívá při teplotě 56 ° C po dobu 30 minut ve vodní lázni s občasným třepáním. Účelem je inaktivovat všechny složky komplementového systému přítomné v FBS a další potenciální neznámé inhibitory buněčného růstu., Dříve tepla-inaktivace byla také určena k odstranění kontaminace mycoplasma, což je již problém, protože všechny sérum produkty jsou nyní filtrovány přes velikostí pórů dostatečně malé, aby odstranit mycoplasma. Je třeba poznamenat, že tepelná inaktivace může mít také nežádoucí účinky, jako je snížení schopnosti kultivovaných buněk připojit se k povrchům .
několik dodavatelů vyzvalo uživatele, aby neaktivovali FBS pro většinu potřeb buněčné kultury., V každém případě je vhodné vyhodnotit potřebu tepelné inaktivace v konkrétní aplikaci, protože různé buňky mají různé reakce na tepelnou inaktivaci FBS .
Kromě toho, stejně jako všechny ostatní protokoly, s ohledem na FBS, tepelné inaktivace proces musí být provedeno s opatrností, protože příliš vysoká teplota nebo déletrvající vytápění bude inaktivaci růstových faktorů, a vytvářet sraženiny.
HY Chew et al zachována A431, HCC1569, MCF7, MDA-MB-231, MDA-MB-468, SCC25, SKBR3, T47D, RENCA a CT26.WT buněčné linie v médiích s 10% (v/v) tepelně inaktivované FBS ., Freeman SA et al používá tepelně inaktivované FBS po celou dobu ve své studii na makrofágy . Aikawa t et al Kultivované myší primární gliové buňky na Poly–D-lysinu potažených baňkách v DMEM obsahující 10% tepelně inaktivovaných FBS z Miliporesigmy (F2442) . Feldman, D et al kultivované HEK293FT buněk v DMEM doplněna tepelně inaktivované fetální hovězí sérum z Seradigm (97068-085) a A549, HCT116, HT1080, A375 buňky s tepelně inaktivované fetální hovězí sérum od Sigma (F4135) k vyhodnocení optické sdružené obrazovky ., Kulkarni s et al udržované Hut-78 buňky s tepelně inaktivované fetální bovinní sérum z Atlanta Biologicals .
aktivní uhlí může se vážou na lipofilní molekuly, a proto se používá k odstranění hormonů, jako je androgen, estrogen, progesteron, kortizol, testosteron, trijodtyronin (T3) a tyroxin (T4) od FBS. Tyto hormony lipidů v séru mají tendenci interferovat s imunotestními systémy a metodami analýzy inzulínu. L Zhao et al měří růst nádorových buněk v kultivačních médiích doplněných o 10% sérum zbavené uhlí .,
dialýza může odstranit všechny molekuly s molekulovou hmotností nižší než 10 000 MW z FBS. To zahrnuje jak polární, tak nepolární molekuly. Hormony, cytokiny, glukóza, aminokyseliny a mnoho dalších jsou odstraněny. Dialýza také odstraňuje antibiotika a další exogenní molekuly v FBS.
Dialyzed FBS od Thermo Fisher Scientific byl použit v kultuře pankreatu duktální adenokarcinom pro SILAC hmotnostní spektrometr studie a další SILAC studií , a v kultuře HeLa buněk se Setkal analog l-AHA pulse-chase pro click-chemie detekce s dlouhým poločasem rozpadu bílkovin .,
ozařování gama může být součástí procesu sterilizace FBS. FBS se obvykle filtruje přes 0,1 um filtry vícekrát k odstranění mikroorganismů. Ozařování gama může inaktivovat viry běžně přítomné u skotu. Některé virové druhy, jako je parvovirus, jsou však odolné vůči záření gama.
ačkoli FBS má poměrně nízký obsah IgG, i tato úroveň může být pro některé určité aplikace příliš vysoká. Úroveň IgG může být podstatně dále snížena zachycením chromatografie., FBS s nízkým IgG se používá pro produkci protilátek, rekombinantní syntézu proteinů a další aplikace.
Kultura kmenových buněk má přísné požadavky, pokud jde o růstové faktory. Některé z růstových faktorů přítomných v FBS podporují diferenciaci kmenových buněk. Několik společností nabízí embryonální kmenové buňky kvalifikované FBS určené k udržení nediferencovaných kmenových buněk. Je však důležité testovat specifické množství FBS pro jejich použitelnost při udržování pluripotence / totipotence různých typů kmenových buněk., Thermo Fisher poskytuje embryonální kmenové buňky kvalifikované FBS, jako, například, použitý v e14tg2a myši es buněčné kultury Yasuda s et al .
Hlavní země skotu jsou hlavními poskytovateli FBS. Země patří USA, Austrálie, Nový Zéland, Kanada, několik v Jižní a Střední Americe.
výroba a sběr sérových produktů jsou regulovány vládními agenturami. FBS je označen jako USDA-Grade nebo European-Grade., FBS třídy USDA lze dovážet do jakékoli země bez bovinní spongiformní encefalopatie a slintavky a kulhavky, zatímco FBS Evropské třídy lze prodávat ve většině evropských a asijských zemí.
FBS je nejlepší skladovat zmrazené, v rozmezí -5 až -20°C, a může být rozmraženy při teplotě mezi 2 až 8°C. To je často užitečné pro poměrné části a zmrazit sérum v menší porce, často 50 ml zkumavky, aby se zabránilo mnoho mrazem a rozmrazováním. Občas některé alikvoty FBS zůstávají v kapalině při teplotách pod bodem mrazu., To je způsobeno nedostatkem nukleačního centra (částic) pro zahájení krystalizace (zmrazení). Pokud jednoduše otočíte zkumavky prstem, obvykle ztuhnou téměř okamžitě.
po rozmrazení je běžné mít nějakou sraženinu. Sraženiny, pravděpodobně v důsledku denaturace některých sérových proteinů, mohou být vyčištěny krátkou centrifugací, což obecně neovlivňuje kvalitu séra.
mnoho dodavatelů poskytuje FBS různé stupně, zemi původu a léčbu., FBS je sama o sobě složitá směs a lze očekávat variabilitu mezi různými stupni, dodavateli a šaržemi. Proto je nezbytné vytvořit proces výběru a hodnocení FBS. Je to dobrý nápad, aby přezkoumala literatury určit, jak konkrétní výběr FBS byl dříve používán v podobné oblasti výzkumu, nebo pro stejné buněčné kultury a věnovat velkou pozornost na potenciální mnoho variací v FBS. Abychom s tím pomohli, Labome provedla průzkum využití FBS z vědeckých publikací, diskutováno níže, pomoci našim návštěvníkům vybrat nejvhodnější FBS.,
labome zjišťuje literaturu o použitých materiálech. Zde jsou shrnuty publikace, které citovaly fetální bovinní sérum. Publikace jsou náhodnou podmnožinou více než 10 000 publikací.
hlavní dodavatelé FBS jsou Life Technologies (nyní součást Thermo Fisher Scientific), Thermo Fisher Scientific Hyclone (nyní součástí skupiny GE LifeScience), a MilliporeSigma (Tabulka 2).
Life Technologies je globální biotechnologická společnost se sídlem v Karlových Varech v Kalifornii., Vznikla v roce 2008 sloučením Invitrogen Corporation a Applied Biosystems Inc. Mnoho z jejich produktů je pod značkou Gibco. Poskytují produkty buněčné kultury, jako je buněčné kultivační médium, FBS a další relevantní činidla. Společnost se v roce 2014 sloučila s Thermo Fisher Scientific.
FBS od Life Technologies byl použit ke studiu jadérko jako fáze odděleny protein kontroly kvality subjektu v HEK293T a HeLa buňky ., Pandolfiniho L et al kultivovaných HEK293T a buněk A549 v DMEM doplněném 10% Gibco FBS (10270-106) a Caco-2 buněk v Eagle ‚ s Minimum Essential Medium doplněny 20% Gibco FBS (10270-106) . Hek293t buňky jsou poměrně často udržovány s 10% fetálním hovězím sérem od Thermo Fisher .
GE Healthcare Hyclone FBS je široce používán. De Cecco m et al ji použil na 15% k udržení senescentních fibroblastů LF1, IMR-90 a WI-38 v médiích Ham F – 10 ., Nicetto D et al používá Hyclone FBS (SH30071) ukončit trypsin trávení a udržovat embryonální buňky . Laflamme C et al udržoval buňky HEK – 293 v DMEM s vysokým obsahem glukózy z GE Healthcare (SH30081.01) obsahující 10% sérum hovězího tele z GE Healthcare (SH30072.03) .
Frohner TJ et al zachována Neuro-2a (N2a) a Cos-7 buněk z American Type Culture Collection v DMEM obsahujícím 10% FBS z Bovogen, Francie . Laflamme C et al Kultivované buňky u2os v dmem s vysokým obsahem glukózy obsahující 10% fetálního bovinního séra bez tetracyklinu od Wisent (081150) . Dong JX et al udržoval primární hippocampální kultury na Matrigelu z Corningu s 5% fetálním bovinním sérem z Atlanta Biologicals (S11550) ., Lee a et al Kultivované myší c2c12 myoblasty s DMEM doplněné o 10% fetálního bovinního séra z VWR (89510-186) . Zhao N et al kultivované U2OS buňky z ATCC (HTB-96) v DMEM médium s 10% (v/v) fetální hovězí sérum z Altas Biologicals . Liu X et al Kultivované myší 4T1 buňky v DMEMsupplemented s 10% fetální bovinní sérum z Biochrom .