Zvířata
Všechny experimenty byly prováděny za použití non-chovatel mužské a ženské C57/B6 myší (2-3 měsíců). Každý sex přispěl ke zhruba polovině celkového počtu zvířat v každém experimentu. Zvířata byla umístěna v cyklu 12/12 h tmavé/světlé a měla neomezený přístup k jídlu a vodě., Použití myši v těchto experimentů byly v souladu s pokyny pro Péči a Použití Laboratorních Zvířat a experimentální protokoly byly schváleny University of Southern California Institucionální Animal Péče a Používání Výboru (IACUC).
vystavení Světlu
Oči byly rozšířené, s 0,5% Tropikamid Oční Roztok, USP (AKORN) a 2,5% Fenylefrin-Hydrochlorid, Oční Roztok, USP (AKORN). Myši byly přes noc tmavé., Oni byli drženi ve tmě, nebo vystaven difuzní studené bílé zářivkové světlo na luminiscence úrovni 5000 luxů po dobu 30 min až 1 h před utraceno. Tmavě přizpůsobit vzorky pro obě metody byly připraveny v temné komoře pod infračerveným světlem a všechny postupy zahrnující přizpůsobené tmě tkáně bylo provedeno pomocí mikroskopem vybaveny infračervené převodníky (B. E. Meyers & Co, Inc.). Světelné exponované vzorky byly zpracovány v rámci disekčního rozsahu v pokojovém světle.,
pitva sítnice
myši byly eutanizovány inhalací isofluranu a následnou cervikální dislokací. Oči byly enukleovány a sítnice byly izolovány v Petriho misce o rozměrech 35 × 10 mm naplněné vhodným pufrem/roztokem popsaným níže. Rohovka, čočka a sklivec byly odstraněny z každého oka a retinální pigmentový epitel (RPE) a skléry byly pečlivě oloupali z každé sítnice. Izolované sítnice byly hemisected s perem skalpel v 60 × 15 mm misky a okraje byly zdobené vyvolat dva obdélníky., Minimalizace zakřivení každé poloviny sítnice pomohla zploštění sítnice a zajistila přesné odlupování vrstev sítnice. Správné stříhání, skládání okrajů sítnice je zásadní: je-li sítnice má skládací okraje, pokud jsou umístěny na filtrační papír, bude to mít za následek snížení výnosu izolovaných ROS a co je důležitější, bude kontaminovaný ostatní retinální vrstvy.
imunocytochemie
před enukleací byl Nadřazený pól rohovky označen kauterizací a následně byla odstraněna rohovka, čočka a sklivec., Zbývající oční šálky byly umístěny ve 4% paraformaldehydu v PBS po dobu 15 minut a opláchnuty 3krát po dobu 10 minut v PBS. Oko poháry byly cryoprotected v 30% sacharóza v PBS po dobu 2 h, umístěné v Tkáni-Teck® O. C. T. compound (Sakura Finetek, USA) a rychle zmraženy v kapalném N2. Zmrazené bloky byly nařezány na 10 µm v kryostatu (CM 3050 S, Leica Microsystems) a skladován v -80 °C. Před protilátkou, inkubace, sekce byly rovnovážného stavu na pokojovou teplotu (RT) po dobu 15 min., Pro GNAT1 barvení pomocí TF-15 myší monoklonální protilátka, epitope retrieval byla provedena: sekce byli léčeni po dobu 2 min, RT s 0,02 mg/ml proteináza K v blokujícím pufru (2% bovinní sérový albumin, 2% kozím séru, což je o 0,3% Triton X-100 v 1X PBS) a zahřívána na 65 °C po dobu 10 s, následovaný o pět máchání s PBS. Blokovací pufr byl pak aplikován na všechny úseky za 1 h. Řezy byly inkubovány buď s králičí protilátka proti ARR1 (C10C10 zředí v poměru 1:100 v blokujícím pufru) nebo TF-15 (CytoSignal, ředěné 1:200 v blokujícím pufru)., Sekce byly opláchnuty a inkubovány sekundární protilátkou označenou fluoresceinem (Vector Laboratories). Všechny úseky byly poté dvakrát obarveny biotinylovanou protilátkou proti rhodopsinu (1D4 zředěný 1:300 v blokujícím pufru). Sekce byly opláchnuty a inkubovány rhodaminem Avidinem D (1:100, Vector Laboratories). Snímky byly získány pomocí mikroskopu Zeiss AxioPlan2. Světelné a tmavé podmínky byly zobrazeny pomocí stejných expozičních časů.,
ROS kolekce sekvenční peeling s filtrační papír
filtrační papír peeling metoda byl upraven od technika, vystavit fluorescenčně označené bipolární buňky sítnice plochý držák pro patch clamp nahrávky . Odlupování více vrstev fotoreceptorové buňky filtračním papírem postupně vystavuje dendrity bipolárních buněk a buněčná těla pro snadnější přístup k elektrické stimulaci a čtení náplastí. Zjistili jsme, že loupané vedlejší produkty, vrstvy fotoreceptoru, které jsou přilepené na filtračním papíru, byly přístupné pro následné analýzy Western blot.,
amesovo médium bylo použito pro manipulaci s živou sítnicovou tkání (Sigma-Aldrich A1420). Dva různé pufry byly připraveny: Amesův-HEPES (na 1 L přidat 2.38 g HEPES, 0.877 g NaCl, pH 7.4) a Amese-sodný (na 1 L přidat 1,9 g NaHCO3, pH 7.4). Oba byly připraveny předem, sterilní filtrovány a skladovány při 4 °C.všechny postupy byly provedeny při RT., Před sítnice pitva, 50-100 mL Amese-HEPES byl bublal se 100% O2 v GibcoTM 100 mL média láhev (Thermo Fisher, USA) a 50-100 mL Amese-hydrogenuhličitan byl bublal s 95% O2 a 5% CO2 v světlo-těsný kontejner pro 15-20 min před použitím.
Sítnice byly připraveny, jak je popsáno v Sítnici pitva sekce a uloženy v světlo nepropustném kontejneru s Ames-hydrogenuhličitan bublal s 95% O2 a 5% CO2 udržovat fyziologické pH., Tato inkubační stav je shodný se používá sítnice fyziologové pro ex vivo elektroretinogram nahrávky nebo sací elektrody nahrávky , a může udržovat tkáně životaschopnost a funkčnost po dobu několika hodin. Pro každý postup loupání byl použit poloviční kus obdélníkové oříznuté sítnice. Tkáň byla převedena přes 1,7 mL plastový převod pipetování (tip cut) do 35 × 10 mm petriho misky obsahující okysličenou Amese-HEPES. Média byla během peelingu osvěžována každých 10 minut, aby se udržel okysličený stav., Sítnice v roztoku byla orientována stranou fotoreceptoru směrem dolů pomocí pinzety a přenosové pipety. 5 mm × 2,5 mm obdélníkový kus filtračního papíru, řez od VWR třída 413 filtrační papír (průměr 5,5 cm, velikost pórů 5 µm, VWR, USA) byl umístěn do petriho misky vedle sítnice. Sítnice byla pečlivě přesunuta pinzetou (lehce držící okraje) na filtrační papír se stranou fotoreceptoru dolů. Jakmile byla sítnice soustředěna na filtrační papír, oba byli pečlivě zvednuti z Ames‘-HEPES., Na spodní straně filtrační papír (strana bez retina) byla blotována na papírový ručník, aby nasákly kapaliny na filtrační papír (2-3 stopy). To vytvořilo bezpečnou adhezi mezi fotoreceptorovými buňkami a vlákny filtračního papíru a toto připojení bylo důležité pro odstranění vrstvy ROS. Kapka Amese-HEPES z petriho misky byla umístěna na sítnici, a filtrační papír osušila zase na papírový ručník. To se opakovalo celkem třikrát., Filtrační papír se sítnicí byl poté umístěn zpět do Petriho misky a ponořen a tkáň odstraněna z filtračního papíru pinzetou. Byla věnována pozornost pouze extrémnímu obvodu sítnice, aby se zachovala strukturální integrita sítnice. Pro usnadnění loupání proces, okraje sítnice byly lehce oloupaný pryč od filtru papír z každé strany, uvolnění adheze sítnice k filtrační papír., Jakmile byla sítnice odstraněna z filtračního papíru, spodní povrch filtračního papíru byl odstraněn na papírovém ručníku a umístěn do zkumavky označené +ROS a byl udržován na ledu. Výše popsaný proces loupání se opakoval přibližně 7-8krát. Po 5 slupkách se sítnice stala tenčí, průhlednější a byla náchylná k roztržení. Po odlupování byla zkumavka +ROS obsahující shromážděné filtrační papíry a zbývající loupaná poloviční sítnice umístěna do zkumavky-ROS, zmrazena na suchém ledu a skladována při -80 °C.,
oddělení fotoreceptorových oddílů loupáním lyofilizované sítnice
tato metoda byla upravena z metody popsané M. E. Guido a kol. ,, kdo navrhl ScotchTM pásky peeling metoda, která použity lyofilizované holka sítnice selektivně oddělit sítnice do různých vrstev (fotoreceptorových buněk, vnitřní nukleární vrstva, a gangliové buňky)., Od sítnice z různých zvířecích modelech mají různé tyče a kužele distribucí a může oddělit asymetricky s páskou po lyofilizace, přizpůsobili jsme tuto metodu a prozkoumal jeho nástroj pro separaci tyč prostory myši sítnice.
byly připraveny lyofilizace izolovaných Retin
Retin, jak je popsáno v části „retinální disekce“. Během pitvy byl použit studený Ringer (130 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 2,4 mM MgCl2, 1,2 mM CaCl2, 10 mM HEPES, 0,02 mM EDTA, pH 7,4). Mohly by být použity i jiné fyziologické pufry, jako jsou Ames‘-HEPES., Protože více vzorky byly často řešeny ve stejnou dobu, 5 × 2,5 mm filtrační papír, figurky (Whatman® Třídy 1 Kvalitativní filtrační papír (průměr 9 cm, velikost pórů 11 µm, GE Healthcare, USA)) byly označeny dopředu, než byly umístěny do petriho misky naplněné studenou ringerova pufru. Pro každý vzorek, na polovinu, obdélníkový kus sítnice byl umístěn na filtrační papír pomocí 1,7 mL přenos pipetování (řez tip) s gangliových buněk stranou dolů a fotoreceptorů vnější segment stranou nahoru., Jakmile tkáň byla zaměřena na filtrační papír, oba byly zrušeny z ringerova pufru a spodní části filtrační papír (strana bez retina) byla blotována na papírový ručník (2-3 stopy) k usnadnění připevnění gangliových buněk vrstva na filtrační papír. Na sítnici byla umístěna kapka studeného vyzvánění a spodní část filtračního papíru byla znovu odstraněna na papírovém ručníku. To se opakovalo celkem třikrát. Ringerův pufr byl po každé přípravě vzorku vyměněn za nový pufr studeného Ringera., Filtrační papír s připojenou sítnicí byl umístěn do Petriho misky naplněné studeným vyzváněcím kroužkem, dokud nebyly všechny vzorky zpracovány stejným způsobem. A konečně, každá byla znovu vytažena z roztoku, ve spodní části filtrační papír osuší, a kapka studeného PBS umístěny na filtrační papír vedle sítnice, dna filtr opět vymazána, a umístěny do čisté a suché, 35 × 10 mm petriho misce. Účelem tohoto kroku bylo vypláchnout složitější vyzvánění s PBS, aby se snížilo množství sušené soli na lyofilizované tkáni., Po všechny vzorky tkání byly zpracovány s touto poslední máchání krok a shromažďovány do čisté petriho misky, jídlo bylo zabalené světlo těsný s dvěma vrstvami 2,5 × 2,5 palcový čtvercové kusy hliníkové fólie, s malými otvory, takže přizpůsobené tmě sítnice vzorky nejsou vystaveny světlu, a rychle zmraženy v kapalném N2. Malé otvory dovoleno kapalného N2 přístup do interiéru, plnění petriho misky, a péče byla přijata, aby bylo zajištěno, že otvory byly vyrovnány tak, že petriho misky bylo zabalené světlo-těsný., Petriho miska byla poté umístěna do 600 mL baňky Labconco pomocí Lyofilizátoru VirTis Benchtop 2 K (SP Scientific, USA) po dobu 30 minut, aby lyofilizovala tkáň.
Odlupování vrstev sítnice pomocí ScotchTM pásky
Freeze-sušené retinální tkání byly skladovány při -80 °C v DrieriteTM (W. a. Hammond Drierite Co, USA) naplněné nádoby nebo byly izolovány jako +ROS +RIS, a -ROS/RIS-vyčerpané tkáně (-OIS), zmrazené opět jako výše, nebo zpracované pro Western blot stejný den. Všechny peelingové procedury byly prováděny pod pokojovým světlem. Proužky menší než 2.,Šířka 5 mm byla řezána a umístěna na okraji dávkovače pásky, dokud nebyla oříznuta na obdélníkové kusy. Lyofilizovaná sítnice upevněná na filtrační papír Whatman® byla umístěna do čisté Petriho misky o průměru 10 cm. Malý obdélníkový kus pásky ScotchTM (o něco větší než povrch tkáně) byl řezán a pečlivě položen na lyofilizovanou sítnici. Umístění pásky na horní část lyofilizované sítnice bylo téměř dostačující k připevnění oranžově zbarvené vrstvy ROS na pásku., Pro zajištění úplného kontaktu ROS s páskou byl na horní část pásky aplikován mírný tlak pinzetou, aby byl zajištěn kontakt s horním povrchem. Po pečlivém odlupování pásky byla oranžově zbarvená vrstva ROS přilepena k pásku a oddělena od zbytku sítnice. Tato frakce byla označena + ROS a umístěna do čisté trubky z mikrovláken. Často byl na zlomeném povrchu oranžové vrstvy na první pásové slupce viditelný tenký bílý film., Tento povrch byl odstraněn více páskovými peelingy, dokud nebyl zcela odstraněn a oranžová barva vrstvy ROS byla přivedena na povrch. Tato bílá vrstva původně připojená k ROS byla umístěna do samostatné trubice a označena + Ris frakce. Páska byla použita k odstranění zbylé sítnicové tkáně z filtračního papíru a byla umístěna do zkumavky označené-OIS., Množství tlaku se aplikuje na pásku pro počáteční kůry z pomeranče-tónovaná ROS vrstva ovlivněna jak lyofilizovaný vzorek fractioned; příliš velký tlak způsobil celou lyofilizované sítnice sloupnout papírový filtr na pásku a příliš málo tlaku ne samostatný horní oranžová vrstva od sítnice. Několik průchodů přes pásku pomocí minimálního tlaku pomocí pinzety bylo užitečné při pocitu minimálního a maximálního tlaku, který se přidá k horní části pásky.,
příprava Vzorků pro Western blot: peeling s filtrační papír
+ROS zkumavky obsahující filtrační papíry byly podrobeny rychlé rotaci v mikroodstředivce pro 2 s a přebytečná kapalina se odstraní. Každá zkumavka byla zpracována jednotlivě (jedna poloviční sítnice) nebo dvě zkumavky (dvě poloviční sítnice) byly kombinovány pro koncentrovanější materiál. Izolát + ROS v jedné zkumavce byl homogenizován v 45-60 µL pufru studené ripy (50 mM tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100,1% deoxycholát sodný, 0,1% SDS, 1 mm EDTA, 0.,1 M PMSF, kompletní mini proteázový inhibitor (Roche Applied Sciences)) a izolát-ROS v jedné zkumavce byl homogenizován v 80-100 µL Ripa pufru. Při kombinaci dvou zkumavek bylo pro homogenizaci + ROS použito 80-110 µL studeného Ripa pufru a pro-ROS bylo použito 100-150 µL studeného pufru. Všechny trubky byly homogenizovány po dobu 1 minuty autoklávovaným paličkou. Velká péče byla přijata, aby se ujistil, že filtrační papír kousky v +ROS trubky byly vedeny na straně trubky a zůstat v kontaktu s paličkou místo toho uvízl na dně., Po homogenizaci byly sterilní pinzety použity k přesunutí kusů filtračního papíru na stranu trubice + ROS, následované 2-4 s odstřeďováním v mikrocentrifuge. Tento spin extrahované kapaliny z papíru, a kapalina byla převedena do čisté zkumavky a zpracovány pro Western blot, jak je popsáno níže. Jednalo se o časově nejnáročnější krok, a pokud nebude proveden správně, velká část vzorku může nakonec být absorbována kousky filtračního papíru. Chcete-li maximalizovat obnovu vzorku, velikost filtračních papírových kusů používaných pro slupky by měla být oříznuta tak, aby odpovídala oblasti sítnicové tkáně.,
příprava Vzorku: peeling s ScotchTM pásky
Podobný filtr peeling metoda, dvě trubky, z nichž každá obsahuje oloupané vrstvy z jedné poloviny sítnice, byly spojeny ke zvýšení koncentrace bílkovin. + Vzorky ROS a + RIS byly homogenizovány ve vzorcích 100-115 µL a-OIS ve 125 µL studeného Ripa pufru. Všechny trubky byly homogenizovány po dobu 1 minuty. Velká péče byla přijata, aby se ujistil, že páska v +ROS +RIS, a -OIS trubky zůstali v kontaktu s paličkou a že páska byla stále na straně trubky místo toho uvízl na dně., Po homogenizaci byly sterilní pinzety použity k přesunu kusů pásky na stranu trubek. Zkumavky se točily v mini odstředivce po dobu 2-4 s, po které byly vysušené kusy pásky pečlivě odstraněny.
kvantifikace Proteinů, gelová elektroforéza a proteiny immunoblots
BCA protein assay kit (Thermo Scientific, USA) byl použit pro stanovení celkového množství bílkovin v každém vzorku. Do vzorků byly přidány dva mikrolitry DNaseI (10 jednotek / µL, Roche, Švýcarsko) a byly ponechány při pokojové teplotě po dobu 30 minut., Do homogenátu byl přidán odpovídající objem pufru vzorku 4x SDS (40% glycerolu, 240 mM Tris báze pH 6,8, 8% SDS, 5% ßME, 0,04% Bromfenol blue).,tr>
Approximately 10 μg of protein lysate was loaded per lane and separated on a pre-cast polyacrylamide Bis-Tris gel with a 4–12% gradient (Life Technologies, USA) and transferred onto nitrocellulose membrane., Membrány byly blokovány v 10% mléka/TBS-T pufru po dobu 1 h při RT a inkubovány přes noc s následující protilátky: králičí anti-ARR1 protilátek (1:1000, ref), mouse anti-GNAT1 monoklonální protilátka (TF-15, 1:1000, CytoSignal), rabbit anti-β-aktin protilátkou (1:5000, GeneTex Inc.), králík Anti-rgs9 protilátka (1:1000), králík anti-Gß5L/s (CT215) (1:2000) a králík Anti-cytochrom C polyklonální protilátka (1:500, Santa Cruz, sc-7159). Membrány byly inkubovány s fluorescenčně značenými sekundárními protilátkami (1:10 000, li-COR Biosciences) při RT po dobu 1 hodiny., Proteinové pásy byly detekovány infračerveným zobrazovacím systémem Odyssey® (LI-COR Biosciences, USA) a intenzita fluorescence jednotlivých pásem byla kvantifikována pomocí ImageJ. Signály GNAT1, ARR1 a RGS9 byly normalizovány proti vzorkům Gß5L pro vzorky +ROS, +RIS a proti vzorkům actin pro-ROS a-OIS. Pro každý nezávislý experiment byly fluorescenční signály pro každý protein v každém oddělení také normalizovány proti kombinovaným signálům ze všech oddělení sítnice. K určení rozdílů mezi dvěma skupinami byly použity nepárové 2-sledoval t-testy.