co je RNA-seq?
RNA-seq (RNA-sekvenování) je technika, která může zkoumat množství a sekvence RNA ve vzorku pomocí příští generace sekvenování (NGS). Analyzuje transkriptom genových expresních vzorků kódovaných v naší RNA. Zde se podíváme na to, proč je RNA-seq užitečná, jak technika funguje, a základní protokol, který se dnes běžně používá1.
jaké jsou aplikace RNA-seq?,
RNA-seq nám umožňuje zkoumat a objevovat transkriptom, celkový buněčný obsah RNA včetně mRNA, rRNA a tRNA. Pochopení transkriptomu je klíčové, pokud máme spojit informace o našem genomu s jeho funkční proteinovou expresí. RNA-seq nám může říct, které geny jsou zapnuty v buňce, jaká je jejich úroveň exprese a v jakých časech jsou aktivovány nebo vypnuty2. To umožňuje vědcům hlouběji porozumět biologii buňky a posoudit změny, které mohou naznačovat onemocnění., Některé z nejpopulárnějších technik, které používají RNA-seq jsou transkripční profilování, identifikace SNP, RNA editace a diferenciální genová exprese analysis3.
To může vědcům poskytnout důležité informace o funkci genů. Například transkriptom může zvýraznit všechny tkáně, ve kterých je exprimován Gen neznámé funkce, což může naznačovat, jaká je jeho role. Zachycuje také informace o alternativních spojovacích událostech (Obrázek 1), které produkují různé přepisy z jedné genové sekvence. Tyto události by nebyly zachyceny sekvenováním DNA., To může také identifikovat post-transkripční modifikace, které se vyskytují při zpracování mRNA jako polyadenylation a 5′ capping2.
Obrázek 1: data RNA-seq používají krátké čtení mRNA, které neobsahuje intronickou nekódující DNA. Tyto čtení pak musí být zarovnány zpět k referenčnímu genomu.
jak funguje RNA-seq?
rané techniky RNA-seq používaly technologii sekvenování Sanger, techniku, která byla v té době inovativní, byla také nízká propustnost, nákladná a nepřesná., Teprve nedávno, s příchodem a proliferací technologie NGS, jsme byli schopni plně využít potenciál RNA-seq4.
první krok v technice spočívá v převodu populace RNA být seřazeny do cDNA fragmentů (cDNA knihovny). To umožňuje, aby RNA byla vložena do pracovního postupu NGS. Adaptéry se pak přidávají na každý konec fragmentů. Tyto adaptéry obsahují funkční prvky, které umožňují sekvenování; například prvek zesílení a místo primárního sekvenování., Knihovna cDNA je pak analyzována NGS, produkovat krátké sekvence, které odpovídají buď jeden nebo oba konce fragmentu. Hloubka, do které je knihovna sekvenována, se liší v závislosti na technikách, pro které budou použita výstupní data. Sekvenování často následuje buď jedno-číst nebo spárované – end sekvenování metody. Single-číst sekvenování je levnější a rychlejší technika (pro referenci, asi 1% z ceny Sanger sekvenování), které sekvence cDNA z jednoho konce, zatímco spárované-end metody, sekvence z obou stran, a proto jsou dražší a časově consuming5,6.,
další volba musí být provedena mezi strand-specifické a non-pramen-konkrétní protokoly. První metoda znamená, že informace o tom, který řetězec DNA byl přepsán, jsou zachovány. Hodnota dodatečných informací získaných z pramenné specifické protokoly, aby jim příznivá varianta.
Tyto hodnoty, který tam bude mnoho milionů do konce workflow, pak může být zarovnán do genomu referenční a smontované k produkci RNA sekvence mapu, která pokrývá transcriptome7.,
RNA-seq vs microarrays: proč je RNA-seq považována za nadřazenou
RNA-seq je široce považována za nadřazenou jiným technologiím, jako je hybridizace mikroarray. Existuje několik důvodů pro RNA-seq je dobře-pokládaný stav
RNA-seq protocolExperiment Plánování
Příprava před zahájením své RNA-seq experiment je zásadní. Otázky k zodpovězení před spuštěním zahrnují10:
* jakou metodu čištění RNA používáte?
* kolik čtení budete potřebovat?
•kterou platformu budete používat?,
•jaký referenční genom použijete?
* jak hodnotíte kvalitu RNA?
* potřebujete obohatit svou cílovou RNA?
* budete čárový kód RNA?
* mám dostatek biologických a technických replikátů?
•jedno-číst nebo spárované-end sekvenování?
Příprava knihovny cDNA
po zvážení těchto bodů můžete začít připravovat knihovnu cDNA. To bude vyžadovat přidání platform-specific „adaptér sekvence“ a amplifikace DNA, ale přesný postup bude velmi specifické pro platformu použity v této fázi., Amplifikace DNA zahrnuje reverzní transkriptázy zprostředkované první části syntézy následuje DNA polymeráza-zprostředkované druhý pramen synthesis10,11.
cDNA Sequencing
jakmile je knihovna připravena a přidány adaptéry, můžete použít vybranou sekvenční platformu k sekvenování knihovny cDNA do požadované hloubky. Jakmile jsou vaše přepisová data vytvořena, můžete data mapovat do referenčního genomu., Proces zarovnání může být komplikováno přítomností splice varianty a modifikace, a výběr referenčního genomu používá se také liší, jak je obtížné v této fázi je. Softwarové balíčky, jako je STAR, jsou v této fázi užitečné, stejně jako nástroje pro kontrolu kvality, jako je Picard nebo Qualimap12.
Analýza dat RNA-Seq
po fázi zarovnání se můžete zaměřit na analýzu vašich dat. Nástroje jako Sailfish, RSEM a BitSeq12 vám pomohou kvantifikovat vaše expresní úrovně, zatímco nástroje jako MISO, které kvantifikují alternativně sestříhané geny, jsou k dispozici pro specializovanější analýzu13., Je knihovna těchto nástrojů tam a čtení recenze a zatýkání jsou vaše nejlepší způsob, jak najít ten správný nástroj pro váš výzkum.
abych to shrnul, moderní RNA-seq je dobře zavedená jako vynikající volba pro mikroarrays a pravděpodobně zůstane prozatím preferovanou volbou.
5.https://systemsbiology.columbia.edu/genome-sequencing-defining-your-experiment
6.https://emea.illumina.com/science/technology/next-generation-sequencing/paired-end-vs-single-read-sequencing.html
9.https://cofactorgenomics.com/advantages-rna-seq-over-microarray-technology/
10.http://bioinformatics.ucdavis.edu/docs/2015-june-workshop/_downloads/Th_MB_RNASeq_Intro.pdf
11.https://rnaseq.uoregon.edu/#library-prep-stranded-libraries