16S rRNA-geenin käytetään fylogeneettisiä tutkimuksia, koska se on erittäin säilytetty eri lajien bakteerit ja arkkien. Carl Woese (1977) oli uranuurtaja 16S rRNA: n käytössä. On ehdotettu, että 16S rRNA-geeni voidaan käyttää luotettavana molekyyli kellon, koska 16S rRNA-sekvenssit kaukaista sukua bakteeri-suvusta ovat osoittaneet, on vastaavia toimintoja. Jotkut termofiilinen arkkien (esim. jotta Thermoproteales) sisältävät 16S rRNA-geenin intronit, jotka sijaitsevat erittäin konservoituneita alueita ja voi vaikuttaa hehkutus ”universaali” pohjamaaleja., Myös mitokondriot ja kloroplastiset rRNA vahvistuvat.
yleisin pohjustuspari oli weisburg et al. (1991) ja on tällä hetkellä nimitystä 27F ja 1492R; kuitenkin joitakin sovelluksia lyhyempi amplicons voi olla tarpeen, esimerkiksi 454-sekvensointi titaani kemia pohjamaali pari 27F-534R kattaa V1-V3.Usein 8F käytetään pikemminkin kuin 27F. Kaksi alukkeet ovat lähes identtiset, mutta 27F on M sijasta C. AGAGTTTGATCMTGGCTCAG verrattuna 8F.,
| Pohjamaali nimi | – Sekvenssi (5′-3′) | Ref.,td> | |
|---|---|---|---|
| 805R | GAC TAC CAG GGT ATC TAA TC | ||
| 533F | GTG CCA GCM GCC GCG GTA A | ||
| 518R | GTA TTA CCG CGG CTG CTG G | ||
| 1492R | CGG TTA CCT TGT TAC GAC TT |
PCR and NGS applicationsEdit
In addition to highly conserved primer binding sites, 16S rRNA gene sequences contain hypervariable regions that can provide species-specific signature sequences useful for identification of bacteria.,Seurauksena, 16S rRNA-geenin sekvensointi on tullut vallalla lääketieteellinen mikrobiologia mahdollisimman nopea ja halpa vaihtoehto fenotyyppisiä menetelmiä bakteerien tunnistamiseen. Vaikka se oli alun perin käytetään tunnistamaan bakteereja, 16 sekvensointi oli myöhemmin todettu pystyy uudelleenluokitteluun bakteerit osaksi täysin uusia lajeja, tai jopa sukuihin.Sitä on myös käytetty kuvaamaan uusia lajeja, jotka eivät ole koskaan olleet onnistuneesti viljellyt.,Kolmannen sukupolven sekvensointi tulossa paljon labs, samanaikainen tunnistaminen tuhansia 16S rRNA-sekvenssit on mahdollista muutamassa tunnissa, jolloin metagenomic tutkimukset, esimerkiksi suolistoflooran.
Hypervariaabeli regionsEdit
bakteerien 16S-geenin sisältää yhdeksän hypervariaabelit alueet (V1–V9), jotka vaihtelevat noin 30 100 emäsparia pitkä, jotka ovat mukana toisen asteen rakenne pieni ribosomialayksikköä., Niiden suojeluaste vaihtelee suuresti hypervariaabelit alueet, joissa on enemmän konservoituneita alueita korreloivat korkeamman tason taksonomian ja vähemmän konservoituneita alueita alemmille tasoille, kuten suku ja laji. Kun koko 16S-sekvenssin avulla vertailun kaikki hypervariaabelit alueet, noin 1500 emäsparia pitkä se voi olla kohtuuttoman kallista tutkimuksissa on pyritty määrittämään tai luonnehtivat erilaisia bakteeri-yhteisöjä., Näissä tutkimuksissa käytetään yleisesti Illumina platform, joka tuottaa lukee nopeudella 50-kertainen ja 12,000-kertainen halvempi kuin 454 pyrosekvensointi ja Sanger sekvensointi vastaavasti. Vaikka halvempaa ja mahdollistaa syvemmälle yhteisön kattavuus, Illumina sekvensointi tuottaa vain lukee 75-250 emäsparia pitkä (jopa 300 emäsparin kanssa Illumina MiSeq), ja ei ole protokollan mukaista luotettavasti kokoaminen täysi-geenin yhteisön näytteitä. Koko hypervariaabelit alueet voidaan koota yhden Illumina suorittaa, kuitenkin, mikä tekee niistä ihanteellisia tavoitteita alustan.,
Vaikka 16S hypervariaabelit alueet voivat vaihdella dramaattisesti välillä bakteerien 16S-geenin kokonaisuutena ylläpitää suurempi pituus homogeenisuus kuin sen aitotumallisilla vastine (18S ribosomaalinen RNA), joka voi tehdä linjauksia helpompaa. Lisäksi 16S-geenin sisältää erittäin konservoituneita sekvenssejä välillä hypervariaabelit alueet, joiden suunnittelu universaaleja alukkeita, jotka voidaan luotettavasti tuottaa samoja osia 16S-sekvenssin eri taksonien. Vaikka mikään hypervariable alue ei pysty tarkasti luokittelemaan kaikkia bakteereja verkkotunnuksesta lajiin, jotkut voivat luotettavasti ennustaa tiettyjä taksonomisia tasoja., Monet yhteisön tutkimuksia valitse semi-säilytetty hypervariaabelit alueet, kuten V4 tästä syystä, koska se voi tarjota päätöslauselman phylum tasolla yhtä tarkasti kuin koko 16S-geenin. Vaikka vähemmän suojellut alueet kamppailevat uusien lajien luokittelusta, kun korkeamman luokan taksonomiaa ei tunneta, niitä käytetään usein tiettyjen taudinaiheuttajien havaitsemiseen. Yhdessä tutkimuksessa Chakravorty et al. vuonna 2007 kirjoittajat ominaista V1–V8-alueilla erilaisia taudinaiheuttajia jotta voidaan määrittää, mikä hypervariaabelit alueet olisi erittäin hyödyllistä sisällyttää for disease-erityiset ja laaja-analyyseissä., Muun havainnot, he totesivat, että V3-alueella oli parasta tunnistaa suvun kaikki taudinaiheuttajia testattu, ja että V6 oli kaikkein tarkka erottaa lajien välillä kaikki CDC-katseli taudinaiheuttajia testattu, kuten pernaruttoa.
Vaikka 16S hypervariaabeli alueen analyysi on tehokas työkalu, bakteeri-taksonomiset tutkimukset, se taistelee erottamaan läheisesti liittyvät lajit. Perheet Enterobakteerien, Clostridiaceae, ja Peptostreptococcaceae, laji voi jakaa jopa 99% sekvenssin samankaltaisuus koko 16S-geenin., Seurauksena, V4-sekvenssit voidaan poiketa vain muutaman nukleotidin, jättäen viitetietokantoja pysty luotettavasti luokitella nämä bakteerit alemmilla taksonomiset tasot. Rajoittamalla 16S-analyysi valitse hypervariaabelit alueet, nämä tutkimukset voivat epäonnistua havaita eroja läheisesti taksonien ja ryhmä ne yhteen taksonomisia yksiköitä, siksi aliarvioivat koko monimuotoisuuden näyte. Lisäksi bakteerien genomit voi talon useita 16S geenit, V1, V2 ja V6-alueet sisältävät suurin intraspecies monimuotoisuutta., Vaikka ei kaikkein tarkka menetelmä luokitella bakteeri laji, analyysi hypervariaabelit alueet on edelleen yksi kaikkein hyödyllisiä työkaluja bakteeri-yhteisön tutkimuksia.