Eläimet
Kaikki kokeet suoritettiin käyttäen ei-kasvattaja uros ja naaras C57/B6 hiirillä (2-3 kuukautta vanha). Kunkin sukupuolen osuus eläinten kokonaismäärästä oli kussakin kokeessa noin puolet. Eläimet pidettiin 12/12 tunnin pimeän / valon kiertokulussa ja niillä oli rajoittamaton pääsy ruokaan ja veteen., Käyttö hiiret näissä kokeissa oli Oppaan mukaisesti Hoito ja koe-Eläinten Käyttöä ja kokeellinen pöytäkirjat hyväksyttiin University of Southern California Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
Kevyt altistuminen
Silmät olivat laajentuneet 0,5% Tropikamidi Ophthalmic Solution, USP (AKORN) ja 2.5% Fenyyliefriinin Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP (AKORN). Hiiret olivat yön aikana tummasävyisiä., Ne pidettiin pimeydessä tai alttiina hajanainen viileä valkoinen loisteputki klo luminesenssi taso 5000 luksia 30 min-1 h, ennen kuin se lopetettiin. Tumma-mukautettu näytteitä molemmat menetelmät olivat valmiita pimiössä alle infrapunavaloa ja kaikki menettelyt, joissa tumma-mukautettu kudoksen suoritettiin käyttäen dissecting mikroskooppi on varustettu infrapuna-muuntimet (B. E. Meyers & Co, Inc.). Valolle altistuneet näytteet käsiteltiin leikkelytähtäimellä huonevalossa.,
Retina leikkelyn
Hiiret lopetettiin isofluraani inhalaation jälkeen kohdunkaulan sijoiltaan. Silmät olivat tummentuneet ja verkkokalvot eristettiin 35 × 10 mm petrimaljassa, joka oli täytetty jäljempänä kuvatulla sopivalla puskuriliuoksella/liuoksella. Sarveiskalvo, linssi ja lasiainen poistettiin jokaisesta silmästä ja verkkokalvon pigmentoitunut epiteeli (RPE) ja kovakalvon kuorittiin huolellisesti pois jokaisesta verkkokalvosta. Eristetty verkkokalvot olivat hemisected sulka leikkausveitsellä 60 × 15 mm lautasen ja reunat oli leikattu syntynee kaksi suorakulmiota., Jokaisen puolittuneen verkkokalvon kaarevuuden minimoiminen avusti verkkokalvon litistämisessä ja takasi verkkokalvon kerrosten tarkan kuoren. Oikea leikkaus ja taitto reunat verkkokalvo on olennainen: jos verkkokalvo on taitto reunat, kun asetetaan suodatinpaperi, se johtaa vähentynyt tuotto eristetty ROS ja vielä tärkeämpää on saastuttamia muut verkkokalvon kerrokset.
Immunosytokemia
Ennen kuin enucleation, superior-napainen sarveiskalvon leimasi syöpymisiä ja sarveiskalvon, linssin ja lasiaisen sittemmin poistettu., Loput silmän kupit sijoitettiin 4% paraformaldehydi PBS 15 min ja huuhdellaan 3 kertaa 10 min PBS: llä. Silmän kupit olivat cryoprotected 30% sakkaroosia PBS: 2 h, sijoitetaan Kudos-Teck® O. C. T. yhdiste (Sakura Finetek, YHDYSVALLAT) ja nopeasti jäädytetty nestemäisessä N2. Jäädytetty lohkoja oli leikattu 10 µm: in kryostaatti (CM 3050 S, Leica Microsystems) ja säilytetään -80 °C. Ennen vasta-aineen inkubaatio, kohdat olivat tasapainotettu huoneen lämpötilassa (RT) 15 min., Sillä GNAT1 värjäys käyttäen TF-15-hiiren monoklonaalinen vasta-aine, epitope haku suoritettiin: kohdat hoidettiin 2 min RT 0,02 mg/ml proteinaasi K-puskuri estää (2% naudan seerumin albumiini, 2% vuohen seerumi, joka vastasi 0,3% Triton X-100 1 X PBS) ja kuumennettiin 65 °C 10 s, jota seuraa viisi huuhtelua PBS. Estää puskuri oli sitten soveltaa kaikkiin kohtiin 1 s. Kohdat olivat joko inkuboitiin kani vasta-ainetta vastaan, ARR1 (C10C10 laimennettu 1:100 blocking buffer) tai TF-15 (CytoSignal, laimennettu 1:200 estää buffer)., Osat huuhdeltiin ja inkuboitiin fluoreseiinilla merkityllä sekundaarisella vasta-aineella (Vektorilaboratoriot). Kaikki osat oli sitten kaksinkertainen-värjätään biotinylated vasta vastaan rodopsiinin (1D4 laimennettu 1:300 estää buffer). Osat huuhdeltiin ja inkuboitiin rhodamiini Avidin D: llä (1: 100, Vektorilaboratoriot). Kuvat saatiin Zeiss AxioPlan2-mikroskoopilla. Valo-ja tummat olosuhteet imagoitiin identtisillä valotusajoilla.,
ROS kokoelma peräkkäisiä kuorinta suodatinpaperi, –
suodatin paperi kuorinta menetelmä oli muokattu tekniikka paljastaa fluoresoivasti merkitty kaksisuuntainen solujen verkkokalvon tasainen mount patch clamp-tallenteet . Kuorinta pois photoreceptor solun useita kerroksia suodatinpaperilla vähitellen altistaa bipolar cell dendrites ja solujen elinten helpommin sähkö-stimulaatio ja patch-clamp-lukemat. Huomasimme, että kuoritut sivutuotteet, suodatinpaperiin juuttuneet fotoreseptorikerrokset, kelpasivat myöhempiin Western blot-analyyseihin.,
Amesin väliainetta käytettiin elävän verkkokalvon kudoksen (Sigma-Aldrich A1420) manipulointiin. Kaksi eri puskurit valmistettiin: Ames’-HEPES (1 L lisää 2.38 g HEPES, 0.877 g NaCl, pH 7.4) ja Amesin-bikarbonaatti (1 L lisää 1,9 g NaHCO3, pH 7.4). Molemmat valmistettiin etukäteen, steriili suodatettiin ja säilytettiin 4 °C: ssa.kaikki toimenpiteet suoritettiin RT: ssä., Ennen verkkokalvon leikkelyn, 50-100 mL Amesin-HEPES oli kuplina 100% O2 vuonna GibcoTM 100 mL media pullo (Thermo Fisher, USA) ja 50-100 mL Amesin-bikarbonaatti oli kuplina 95% O2 ja 5% CO2, kevyt-astiassa 15-20 min ennen käyttöä.
Verkkokalvot olivat valmistettu kuten on kuvattu ’Retina leikkelyn-osiossa ja tallennetaan kevyt tiukka säiliö Amesin-bikarbonaatti kuplina 95% O2 ja 5% CO2, ylläpitää fysiologinen pH., Tämä inkuboinnin ehto on sama kuin se, jota verkkokalvon physiologists ex vivo èlektroretinogrammu tallenteita tai imu elektrodi tallenteita , ja voi säilyttää kudosta elinkelpoisuutta ja toimivuutta useita tunteja. Jokaiseen kuorintatoimenpiteeseen käytettiin puolitettua kappaletta suorakulmaista lohkottua verkkokalvoa. Kudos siirrettiin 1,7 mL: n muovinsiirtopipetin (tip cut) kautta 35 × 10 mm: n petrimaljaan, joka sisälsi hapetettuja Ames’-HEPEJÄ. Media virkistyi kuorinnan aikana 10 minuutin välein hapetetun tilan ylläpitämiseksi., Liuoksessa oleva verkkokalvo suuntautui fotoreseptorin puolella alaspäin pinsettien ja siirtopipetin avulla. 5 mm × 2,5 mm: n suorakulmainen pala suodatin paperi leikattu VWR-luokan 413 suodatinpaperi (halkaisija 5,5 cm, huokoskoko 5 µm, VWR, USA) oli sijoitetaan petrimaljaan vieressä retina. Verkkokalvo siirrettiin huolellisesti pinseteillä (reunoja kevyesti pidellen) suodatinpaperille fotoreseptorin puoli alaspäin. Kun verkkokalvo oli keskitetty suodatinpaperiin, molemmat nostettiin varovasti pois Amesin-HEPESISTÄ., Suodatinpaperin alaosa (sivu ilman verkkokalvoa) pyyhittiin paperipyyhkeeseen imemään suodatinpaperin nestettä (2-3 Dab). Tämä loi turvallisen tarttuvuuden fotoreseptorisolujen ja suodatinpaperin kuitujen välille, ja tämä kiinnitys oli tärkeä ROS-kerroksen poistamisessa. Pisara petrimaljasta otettuja Ames-HEPEJÄ asetettiin verkkokalvolle, ja suodatinpaperi pyyhki jälleen paperipyyhkeeseen. Tämä toistettiin yhteensä kolme kertaa., Verkkokalvolla oleva suodatinpaperi laitettiin sitten takaisin petrimaljaan ja upotettiin, ja suodatinpaperista poistettu kudos poistettiin pinseteillä. Verkkokalvoa haluttiin kosketella vain äärimmäistä kehää, jotta verkkokalvo säilyisi rakenteellisesti eheänä. Helpottaa kuorinta prosessi, reunat retina olivat varovasti kuoritaan pois suodattimen paperin kummallekin puolelle, irtoaminen kiinnittyminen verkkokalvon suodatin paperia., Kun verkkokalvo poistettiin suodatinpaperista, suodatinpaperin alapinta pyyhittiin paperipyyhkeeseen ja asetettiin +ROS-merkittyyn putkeen ja pidettiin jäällä. Edellä kuvattu kuorintaprosessi toistui noin 7-8 kertaa. 5 kuorinnan jälkeen verkkokalvo oheni, läpinäkyvämmäksi ja repeytyi herkästi. Jälkeen kuorinta, +ROS putki, joka sisältää kerätyt suodatin paperit ja loput kuoritut puolittunut verkkokalvo oli sijoitettu -ROS putki, jäädytettiin hiilihappojään ja säilytettiin -80 °C.,
Erottaminen photoreceptor osastojen kuorinta kylmäkuivattu retina
Tämä menetelmä oli muokattu kuvattu by M. E., Guido et al. , joka on suunniteltu ScotchTM nauha kuorinta menetelmä, joka hyödyntää kylmäkuivattu poikasen verkkokalvot valikoivasti erillisten verkkokalvon eri kerrokset (photoreceptor solut, sisä-nuclear kerros, ja gangliosolujen)., Koska verkkokalvot eri eläinten malleja on eri tanko ja kartio jakaumat ja voi erottaa epäsymmetrisesti teipillä jälkeen kylmäkuivaamalla, me mukautettu tämä menetelmä ja tutkitaan sen hyödyllisyys erottamiseen rod osastojen hiiren verkkokalvot.
eristettyjen verkkokalvojen kylmäkuivaus
verkkokalvot valmistettiin ”verkkokalvon dissektio” -kohdassa kuvatulla tavalla. Kylmä Ringerin (130 mM NaCl, 3.6 mM KCl, 2.4 mM MgCl2, 1.2 mM CaCl2, 10 mM HEPES, 0,02 mM EDTA, pH 7.4) käytettiin aikana leikkelyn. Myös muita fysiologisia puskureita, kuten Ames’-HEPES, voitiin käyttää., Koska useita näytteitä olivat usein käsitellä samaan aikaan, 5 × 2,5 mm suodatinpaperi, – kpl (Whatman® luokka 1 Kvalitatiivisen suodatinpaperin (halkaisija 9 cm, huokoskoko 11 µm, GE Healthcare, USA)) oli merkitty etukäteen, ennen kuin ne sijoitetaan petrimaljaan täytetään kylmällä Ringerin puskuri. Kunkin näytteen, on puolittunut, suorakulmainen pala verkkokalvo oli sijoitettu suodatinpaperi käyttäen 1,7 mL siirtää pipetoi (leikkaa kärki) kanssa ganglion cell puoli alaspäin ja photoreceptor ulompi segmentin puoli ylöspäin., Kun kudos oli keskittynyt suodatinpaperi, sekä nostettiin pois Soittoäänen on puskuri ja pohja suodatinpaperi, – (puoli ilman retina sitä) oli pyyhittäisiin talouspaperilla (2-3 hietakampela) helpottaa kiinnitys ganglion cell layer päälle suodatinpaperi. Tippa kylmää Ringeriä oli sijoitettu verkkokalvolle,ja suodatinpaperin pohja pyyhittiin jälleen paperipyyhkeeseen. Tämä toistettiin yhteensä kolme kertaa. Ringerin puskuri vaihdettiin uuteen cold Ringerin puskuriin jokaisen näytteenvalmistuksen jälkeen., Suodatin paperi kiinnitetty retina asetettiin petrimaljassa täytetään kylmällä Ringerin kunnes kaikki näytteet käsiteltiin samalla tavalla. Lopuksi jokainen oli jälleen nostaa esiin ratkaisu, pohja suodatinpaperi on kuivattu imeyttämällä vesi paperiin, ja tippa kylmää PBS sijoitettu suodatinpaperi vieressä verkkokalvo, suodattimen pohjassa taas pyyhitty, ja laitetaan puhdas ja kuiva 35 × 10 mm petrimaljassa. Tämän vaiheen tarkoituksena oli huuhdella pois monimutkaisemmat Ringer ’ s PBS vähentää kuivasuolan kylmäkuivattua kudosta., Kun kaikki kudos näytteitä oli käsitelty tämän lopullinen huuhtele vaihe ja kerätään osaksi puhdas petri lautasen, ruokalaji oli kääritty valoa tiukka, jossa on kaksi kerrosta 2,5 × 2,5 tuuman neliön paloja alumiini folio, pieniä reikiä, niin että tumma-mukautettu retina-näytteet eivät altistu valolle, ja nopeasti jäädytetty nestemäisessä N2. Pieniä reikiä saa nestemäinen N2-yhteys sisustukseen, täyttö petrimaljaan, ja hoito on otettu varmistaa, että reiät olivat offset niin että petrimaljassa oli kääritty valoa tiukka., Petrimaljaan oli sitten laitetaan 600 mL Labconco pulloon käyttäen VirTis Pöytäasenteiset 2 K Lyophilizer (SP Tieteellinen, USA) 30 min lyophilize kudosta.
Kuorinta verkkokalvon kerroksia, joita ScotchTM nauha
pakastekuivattu verkkokalvon kudosten säilytettiin -80 °C DrieriteTM (W. A. Hammond Drierite Co, USA) täytetty astia tai olivat yksittäisiä kuten +ROS, +RIS-ja -ROS/RIS-köyhdytettyä kudoksen (-OIS), pakastaa uudelleen kuten edellä, tai kehruuta varten Western blotit samana päivänä. Kaikki kuorintatoimenpiteet suoritettiin huoneenvalossa. Nauhat pienempi kuin 2.,5 mm: n levy leikattiin ja asetettiin teipin annostelijan reunaan, kunnes se lohkottiin suorakaiteen muotoisiksi paloiksi. Whatman® – suodatinpaperiin kiinnitetty kylmäkuivattu verkkokalvo sijoitettiin puhtaaseen 10 cm petrimaljaan. Pieni suorakulmainen pala ScotchTM teippiä (hieman suurempi kuin kudoksen pinta) leikattiin ja huolellisesti asetettu päälle kylmäkuivattu verkkokalvo. Asettamalla nauha päälle kylmäkuivattu verkkokalvo oli lähes riittävä kiinnitä oranssi sävyinen ROS kerros nauha., Varmistaa täydellinen kosketus ROS teipillä, pieni paine on sovellettu pinseteillä alkuun nauha varmistaa, yhteyttä yläpinnan. Jälkeen varovasti kuorinta pois nauha, oranssi sävyinen ROS kerros oli kiinni nauha ja erotettu muusta verkkokalvon. Tämä fraktio oli merkitty +ROS ja sijoitettu puhtaaseen mikrofugiputkeen. Usein ensimmäisellä nauhakuorella oranssin kerroksen murtuneella pinnalla näkyi ohut, valkoinen kalvo., Tämä pinta poistettiin lisää teippikuoria, kunnes se poistettiin kokonaan ja Ros-kerroksen oranssi väri tuotiin pintaan. Tämä valkoinen kerros alun perin kiinnitetty ROS oli sijoitettu erilliseen putkeen ja merkitty +RIS murto. Nauha oli tapana poistaa jääneen verkkokalvon kudosta suodatinpaperi ja oli sijoitettu putkeen merkitty-OIS., Määrä paine nauha alkuperäisen kuori oranssi sävyinen ROS kerros vaikuttaa, miten kylmäkuivattu näyte fractioned; liikaa paineita aiheutti koko kylmäkuivattu retina irrota suodatin paperin päälle teipillä ja liian pieni paine ei erillistä ylä-oranssi kerros verkkokalvon. Pari kulkee nauha, käyttämällä mahdollisimman vähän painetta pinseteillä oli hyödyllinen tunne ulos vähimmäis-ja enimmäismäärä paine lisätä alkuun nauha.,
Näytteen valmistelu Western blot: kuorinta suodatinpaperi, –
+ROS sisältävät putket suodatin paperit alistettiin quick spin on microcentrifuge 2 s ja ylimääräinen neste poistetaan. Kukin putki prosessoitiin yksittäin (yksi puolitettu verkkokalvo) tai kaksi putkea (kaksi puolitettua verkkokalvoa) yhdistettiin väkevämpään materiaaliin. N +ROS eristää yhden putken homogenoitiin vuonna 45-60 µL kylmää RIPA buffer-puskuria (50 mM Tris–HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% natriumdeoksikolaatti, 0.1% SDS, 1 mM EDTA, 0.,1 M PMSF, täydellinen mini-proteaasin estäjä (Roche Applied Sciences)), ja -ROS eristää yhden putken homogenoitiin 80-100 µL RIPA-puskuriin. Kun kaksi putket yhdistettiin, 80-110 µL kylmää RIPA-puskuria käytettiin homogenoidaan +ROS ja 100-150 µL kylmää puskuria käytettiin -ROS. Kaikki putket homogenoitiin 1 minuutin ajan autoklavoidulla survimella. Erittäin huolellisesti varmistettiin, että +ROS-putkien suodatinpaperin palaset pidettiin putkien kyljessä ja pidettiin pintakontaktissa sen sijaan, että ne olisivat juuttuneet pohjaan., Homogenisoinnin jälkeen, steriilejä pinsettejä käytettiin siirrä suodatin paperi kappaletta puolella +ROS putki, jonka jälkeen 2-4 s spin microcentrifuge. Tämä spin uutettu neste paperi -, ja neste siirrettiin puhtaaseen putkeen ja käsitellään Western blot, kuten alla on kuvattu. Tämä oli eniten aikaa vievä vaihe, ja jos ei tehdä oikein, paljon näytteen voi päätyä imeytyy kpl suodatinpaperi. Maksimoida elpyminen näyte, koko suodatin paperi kappaletta käytetään kuoria pitäisi olla leikattu vastaamaan alueen verkkokalvon kudosta.,
Näytteen käsittely: kuorinta ScotchTM nauha
Samanlainen suodatin kuorinta menetelmä, kaksi putkea, joista jokainen sisältää kuorittu kerros puolet verkkokalvo, yhdistettiin lisätä proteiinin pitoisuus. + ROS-ja + RIS-näytteet homogenoitiin 100-115 µL: aan ja-OIS-näytteet 125 µL: aan kylmää RIPA-puskuria. Kaikki putket homogenoitiin 1 min. Suurta huomiota on otettu varmistaa, että nauha +ROS, +RIS, ja OIS putket jäi yhteyttä survin ja että nauha oli pidetty puolella putket sen sijaan, että jumissa alareunassa., Homogenoinnin jälkeen putkien kylkeen siirrettiin steriilejä pinsettejä teippipalojen siirtämiseksi. Putket olivat kehrätty mini centrifuge 2-4 s, jonka jälkeen kuivattu kappaletta nauha poistettiin huolellisesti.
Proteiinia määrällisesti, geeli elektroforeesi ja proteiinia immunoblots
BCA protein assay kit (Thermo Scientific, USA) käytettiin määrittämään kokonaismäärä proteiinia kunkin näytteen. Näytteisiin lisättiin kaksi dnasei-mikrolitraa (10 yksikköä/µL, Roche, Sveitsi), jotka jätettiin huoneenlämpöön 30 min., Sopiva määrä 4X SDS sample buffer (40% glyserolia, 240 mM Tris Base pH 6,8, 8% SDS, 5% ßME, 0.04% Bromophenol blue) lisättiin homogenaattia.,tr>
Approximately 10 μg of protein lysate was loaded per lane and separated on a pre-cast polyacrylamide Bis-Tris gel with a 4–12% gradient (Life Technologies, USA) and transferred onto nitrocellulose membrane., Kalvot olivat tukossa 10% maito/TBS-T-puskuriin 1 h RT, ja inkuboitiin yön yli seuraavat vasta-aineet: rabbit anti-ARR1 vasta-aine (1:1000, ref), hiiren anti-GNAT1 monoklonaalinen vasta-aine (TF-15, 1:1000, CytoSignal), rabbit anti-β-aktiini-vasta-aine (1:5000, GeneTex Inc.), rabbit anti-RGS9 vasta-aine (1:1000), rabbit anti-Gß5L/S (CT215) (1:2000), ja kanin anti-sytokromi C polyklonaalista vasta-ainetta (1:500, Santa Cruz sc-7159). Kalvot olivat rauhoitettuna fluoresoivasti merkitty toissijainen vasta-aineita (1:10,000, LI-COR Biosciences) klo RT 1 h., Proteiini bändit olivat havaita Odyssey® infrapuna imaging system (LI-COR Biosciences, USA) ja fluoresenssin intensiteetti yksittäisiä bändejä oli määrällisesti käyttäen ImageJ. GNAT1 -, ARR1-ja RGS9-signaalit normalisoitiin gß5l-näytteille +ROS -, +RIS-näytteille sekä actin for-ROS-ja-OIS-näytteille. Kunkin riippumattoman kokeen osalta kunkin osaston jokaisen proteiinin fluoresoivat signaalit normalisoitiin myös kaikkien verkkokalvon lokeroiden yhdistettyjä signaaleja vastaan. Kahden ryhmän välisten erojen määrittämiseen käytettiin parittomia 2-tailed t-testejä.