Ero muuttoliike holo – ja apo-metalloproteins, jonka MIKROFONIT-BN-SIVU
Vaikka ei ole erottaminen holo- (Fe2-transferriini (Tf)) ja apo-Tf oli havaittu tavanomaisten 1D-native (CBB G-250 free)-SIVU (Kuva. 1a) ja SDS-sivu (Kuva., 1b), mielenkiintoista, huomasimme, että holo – ja apo-Tf ovat täysin erillään avulla MIKROFONIT-BN-SIVU (Kuva. 1c) (on huomattava, että kaksi bändejä havaittiin ”puhdas” apo-Tf näyte käyttäen BN-SIVU ilman MIKROFONIT tilassa, koska metalli-ioni saastuminen; Supplementary Fig. S1). Vuonna SDS-PAGE, tämä on luultavasti koska dissosiaatio metalli-ionit holo-muotoja esiintyy voimakasta denaturointi conditions14,15 (tiedot eivät ole näkyvissä). Tämä viittaa siihen, että elektroforeettinen tunnustamisen välillä holo – ja apo-lomakkeita ei ole saatavilla perinteisen SIVU menetelmiä., Nämä tulokset viittaavat siihen, että nimenomaan heikko denaturointi aineiden, kuten CBB-G 250 työskentelee MIKROFONIT-BN-SIVU, tunnustaa ero holo – ja apo-metalloproteins parantaa erottaminen, lisäksi välttää metalli dissosiaatio.
Eri muuttoliike käyttäytymistä holo – ja apo-muotoja havaittiin myös seruloplasmiini (Cp) sidottu Cu2+ (Cu-Cp) ja superoksididismutaasi (SOD) sidottu Cu2+ ja Zn2+ (Cu/Zn-SOD), jonka MIKROFONIT-BN-PAGE-menetelmällä (Kuva. 1d, e). Apo-muodot siirtyivät asemiin tiiviissä kirjeenvaihdossa tarkkojen molekyylipainojensa kanssa MIC-BN-Pagessa(Kuva., 1: Tf, 77 kDa; Cp, 134 kDa; SOD, 32 kDa), joka on hyödyllinen proteiinien tunnistamisessa. Kuten johdanto-osassa on kuvattu, nämä havainnot johtivat holo/apo-muunnoksen (HAC)-2D MIC-BN-sivun menetelmän kehittämiseen holometalloproteiinien valikoivaa eristämistä varten.
Käsite holo/apo muuntaminen 2D-MIKROFONIT-BN-SIVU
uusi 2D-SIVUN menetelmä, joka perustuu ero välinen muuttoliike holo – ja apo-metalloproteins, alkaa MIKROFONIT-BN-PAGE vaiheessa toteutettiin kaksi kaistaa (kaistat A-ja B-Kuviossa., 2, paneeli I) holo – ja apo-metalloproteiinien erottamiseksi näytteestä, joka sisältää molemmat metalloproteiinimuodot. Kaksi kaistaa ovat sitten joutuneet kaksi eri hoitoja alkuvaiheen jälkeen MICS-BN-SIVUN erottaminen: Lane kohdistuu toisen MIKROFONIT-BN-PAGE vaiheessa, mutta vasta sen jälkeen, kun meneillään holo/apo muuntaminen hoito (Fig. 2 paneeli II-1); Kun taas kaista B toimitetaan metallitunnistussivulle vaiheessa määrittämään erotettuihin proteiineihin liittyvät metalli-ionit (Kuva. 2 paneeli II-2). Kaista B: hen sovellettu käsittely on aiemmin vahvistettu., Esimerkiksi määrittäminen jotkut raskas metalli-ioneja (Cu2+, Fe3+, Co3+, Ni2+, Mn2+ ja Cd2+) pieni tilavuus (µL) näytteitä ppt ja osa-ppb tasot tämän SIVUN menetelmä ilman puhdas huone on ollut reported21. Lisäksi, tämä tandem 1D-MIKROFONIT-BN-SIVU/metalli havaitseminen SIVULLA menetelmät paljasti tarkka jakautuminen Cu2+ ihmisen seerumin jopa heikosti albumiiniin sidottu (vaihdettavissa) Cu2+ 21, ja ehdotti, että periplasmic Rubrivivax gelatinosus CopI proteiinia hyvin mukana kuparin vastus on kupari-sitova protein22., Edelleen, täysin tunnistaa metalli-sidottu proteiineja monimutkainen proteiini näyte on vaikeaa, koska co-siirtyminen proteiineja. Esimerkiksi, se ei ole täysin todistettu, että CopI on kupari-sitovan proteiinin R. gelatinosus, vaikka sen sekvenssi on kolme oletetun Cu-sitova sivustoja: (i) tyypin 1 copper center läsnä monissa cupredoxins kuten azurin ja plastocyanin, (ii) Histidiini-rikas N-terminus järjestyksessä ja (iii) Histidiini/Metioniini-rikas sekvenssi. CopI-liittyvät proteiinit ovat läsnä monet bakteerit, mutta ne eivät ole laajalti säilynyt, esimerkiksi, se on poissa Escherichia coli22., Toistaiseksi vain proteiineja R. gelatinosus ja Vibrio cholerae on tutkittu ja ovat mukana Cu resistance22,23. R. gelatinosuksessa CopI-proteiini ilmaistaan voimakkaasti Cu2+: n läsnä ollessa; Cu-detoksifikaatiomekanismia ei kuitenkaan vielä tunneta. Näin ollen tarvitaan menetelmä metalloproteiinien eristämiseksi kaikista muista kompleksisissa biologisissa näytteissä olevista proteiineista.
Käsite HAC-2D-MIKROFONIT-BN-SIVU/metalli havaitseminen SIVULLA menetelmiä., Paneeli I: 1D MICS-BN-sivu kahdella kaistalla. Lane On joutui in-geeli holo/apo muuntaminen menettely (kuten Paneeli II-1), ja sitten Kaista tehtiin 2D-MIKROFONIT-BN-SIVUN jälkeen holo/apo muuntaminen (kuten Panel III). Kaistalle B tehtiin Cu2+ – ja Fe3+ – tunnistussivu (kuten paneelissa II-2). 2D electropherogram on sekoitus metalloproteins (holo-Tf, apo-Tf, holo-Cp ja holo-SOD), jossa holo-metalloproteins alkuperäisessä näytteessä oli eristetty paikkoja pois poikkiviiva (pilkullinen keltaista line in Panel III). Täysikokoiset versiot elektroferogrammeista, jotka on esitetty kuvassa., 2 on kuvattu kuvassa. S2.
Voit voittaa tämä rajoitus, toimittamien tietojen 1D-MIKROFONIT-BN-SIVU/metalli havaitseminen SIVULLA analyysi Lane B on lisätyn alistamalla Lane toinen ulottuvuus MIKROFONIT-BN-SIVUN jälkeen holo/apo muuntaminen. Vaikutus tämän analyysin Kaista on ensin liottaa happamassa, metalli kelatoi tehokkaasti ratkaisu (katso Menetelmät-osiossa ja Täydentävät tarkemmat ehdot) holo/apo muuntaminen (Fig. 2 paneeli II-1)., Näin holo-metalloproteins ovat derivatisoidun osaksi metalli-vapaa apo-metalloproteins geeli ensimmäisen SIVUN ulottuvuus. Käsitelty Kaista on sitten toimitetaan toinen MIKROFONIT-BN-PAGE vaiheessa tuella metalli-ilmainen agaroosia geeli (ks. lisätiedot). Toisessa MIC-BN-sivun vaiheessa (kuva. 2, paneeli III), apo-metalloproteins ja ei-metalloproteins alkuperäisestä näytteestä siirtyä lävistäjä rivi, koska muuttoliike näiden lajien toisen SIVUN mitta on täysin identtinen niiden maahanmuutto-ensimmäinen SIVU-ulottuvuus., Toisaalta, holo-metalloproteins alkuperäisestä näytteestä siirtyä eri etäisyyksillä ensimmäisen ja toisen MIKROFONIT-BN-SIVUN mitat, koska nämä proteiinit vaeltavat kuin niiden holo-lomakkeet ensimmäisen ulottuvuuden ja niiden apo-lomakkeet toisessa ulottuvuudessa (ja koska MIKROFONIT-BN-SIVU tulokset eri elektroforeettinen liikkuvuus holo – ja apo-muotoja metalloproteins; vide infra). Näin ollen vain holo-metalloproteins alkuperäisestä näytteestä siirtyä pois poikkiviiva toisen ulottuvuuden, jotta tunnistetaan MALDI-TOF MS-ilman ylimääräisiä proteiinin puhdistus., Tyyppejä ja määriä metalli-ioneja sidottu metalloproteins alkuperäisen näyteliuoksen (eristyneitä kuin off-diagonal paikkoja), voidaan määrittää metalli tunnistus, SIVU Lane B, kuten edellä on kuvattu. Näin ollen tietoja, jotka liittyvät tunnistamis-ja metalloprotein lajeja, sekä identiteettien ja pitoisuudet metalli-ioneja ne sitovat, on saatavilla alkaen tämä uusi HAC-2D-MIKROFONIT-BN-SIVU/metalli havaitseminen SIVULLA menetelmiä.,
Selektiivinen eristäminen metalloproteins vuonna HAC-2D-MIKROFONIT-BN-SIVU
For proof-of-concept, HAC-2D-MIKROFONIT-BN-SIVU/metalli tunnistus-SIVULLA oli osoitettu näyte seos, joka sisältää holo-Tf, apo-Tf, holo-Cp ja holo-SOD proteiini vaatimukset (jolloin 2D electropherogram Kuviossa. 2, paneeli III)ja myös ihmisen seeruminäytteen osalta (täydentävä Kuva. S3). Diagonaaliviivalta siirtyneiden holometalloproteiinien täpliä havaittiin onnistuneesti sekaproteiininäytteessä., Lisäksi, Fe3+ oli havainnut asemaa holo-Tf, ja Cu2+ kannat holo-Cp ja holo-SOD, ensimmäinen MIKROFONIT-BN-PAGE vaiheessa käyttäen metalli tunnistus-SIVULLA. Jos holo / apo-muunnosta ei suoriteta, kaikki proteiinit siirtyvät diagonaaliviivalle (täydentävä Kuva. S5). Ihmisen seeruminäytteestä havaittiin onnistuneesti holo-Tf ja holo-CP (täydentävä Kuva. S3)., Näin ollen pääteltiin, että HAC-2D-MIKROFONIT-BN-SIVU/metalli tunnistus-SIVULLA on erittäin tehokas eristäminen holo-metalloproteins ja tunnistaminen metalli-ionien alun perin sidottu metalloproteins proteiini seos.
Lopuksi, HAC-2D-MIKROFONIT-BN-PAGE-menetelmää sovellettiin yhteensä bakteeri-liukoinen fraktio, joka on saatu R. gelatinosus solujen kasvanut läsnäolo 1,2 mM Cu2+, ilmaista CopI proteiinia. Tämä on biologinen proteiininäyte., Tässä näyte, päällä pois poikkiviiva löytyi asema 100 kDa: n ja 29 kDa ensimmäinen ja toinen SIVU, vastaavasti (Kuva. 3 A). Ensimmäisessä MIC-BN-sivulla havaittiin suuri Cu2+-pitoisuus 97-139 kDa: n kohdalla (Kuva. 3 B). Näin ollen pääteltiin, että proteiini tässä on Cu-ion pakko se. Paikalla oli leikattu, ja sitten myöhemmin analysoitiin MALDI-TOF MS Peptidejä, jotka vastaavat CopI on tunnistettu (Kuva. 3c, täydentävä Kuva. S7 ja taulukko S1)., Lisäksi, kun tämä geelitäplä ajettiin SDS-sivulla, havaittiin yksi kaista CopI-proteiinia (tietoja ei näytetty). Toinen piste pois lävistäjä viiva havaittiin noin 40 kDa (yläpuolella 29 kDa CopI paikalla toisessa ulottuvuudessa (Kuva. 3 A). MALDI-TOF MS vahvisti, että kyseinen kohta on peräisin myös Copista (ja oli todennäköisesti molekyylipainon mukaan Copin dimeeri). Näin ollen metalloproteiini voitaisiin erityisesti eristää monimutkaisesta proteiiniseoksesta ja samalla tunnistaa sen sitoutunut metalli., Tämä analyysi HAC-2D-MIKROFONIT-BN-PAGE ehdottomasti osoittautunut, että CopI on kuparia sitova proteiini, ja mielenkiintoista on, että tämä ominaisuus voisi olla liittyvät proteiini on Cu-detoxifying funktio bakteeri periplasm. Lisäksi määrällinen analyysi paljasti stoikiometria Cu t CopI kuin 1:1 (perustuu pitoisuuksien sidottu Cu-ioni (1.05 µM) ja holo-CopI proteiinia (0.95 µM) määritettynä CBB R-250 värjäys). Tämä on täysin samaa mieltä muita kokeellisia tuloksia, jossa todettiin Cu:CopI stoikiometria 1:1.2 käyttäen ICP-MS puhdasta CopI (Durand et al.,, julkaisemattomat tiedot). Tämä tulos viittaa siihen, että menetelmämme on hyödyllinen myös metalloproteiini stoikiometrioiden tutkimuksissa.
HAC-2D-MIKROFONIT-BN-SIVU työllistää hopea värjäys (a), Cu2+ tunnistus-SIVULLA (b), on liukoinen fraktio, joka on saatu R. gelatinosus solujen kasvanut läsnäolo 1,2 mM Cu2+ (yhteensä proteiinia: 31.5 µg). Off-diagonal paikka merkitty tähdellä (a) suoritettiin MALDI-TOF MS (Supplementary Fig., S7), joka tunnistaa punaisella fontilla näytetyt sekvenssit osana CopI mature-sekvenssiä (c). Täysikokoiset versiot elektroferogrammeista, jotka on esitetty kuvassa. 3 on kuvattu täydentävässä Kuvassa. S8.
Capillary electrophoresis kokeita tutkia molekyyli tunnustamista tilaa
resolution enhancement välillä holo – ja apo-lomakkeet MIKROFONIT-SIVU avustivat CBB väriaine (Fig., 1c–e) on tärkeä avain menetelmät, ja, kiinnostavaa kyllä, tämä molekyyli tunnustamista näyttää olevan peräisin eri määrä CBB G-250 väriaine molekyylit sitovat kunkin holo – vs. apo-muotoja metalloproteins. Tämä puolestaan todennäköisesti johtaa eri tehokasta maksuja, ja/tai aiheuttama steric rakenteet, väriaine-proteiini kompleksit. Molemmat vaikutukset vaikuttaisivat elektroforeettiseen liikkuvuuteen., Saada syvempää tietoa siitä, tunnustaminen mekanismi CBB G-250 väriaine sitova kohti holo – ja apo-Tf -, CE-kokeita tehtiin sekä telakointi simulaatiot AutoDock Vina program24,25 (vide infra). CZE suoritetaan ilmainen vesiliuos ilman geeli matriisi, ja niin molekyyli seulonnan vaikutus ei tarvitse pitää simulaatioita. Se elektroforeettinen liikkuvuus holo-Tf mitattuna CZE oli selvästi erilainen kuin apo-Tf lisäksi CBB väriaine (Fig. 4), vaikka näillä proteiineilla oli samanlainen vaihtelevuus ilman väriainetta., Tämä seikka viittaa vahvasti siihen, että holo – ja apo-metalloproteiineihin sitoutuneiden väriainemolekyylien määrä on erilainen. Vuonna CZE -, maahanmuutto-proteiini-väriaine monimutkainen olisi pääasiassa vaikuttaa tehokas veloittaa monimutkainen, joka puolestaan olisi vaikuttanut useita yksittäin ladattu anioniset CBB väriaine molekyylit sidottu proteiini.,
Tyypillinen electropherograms alkaen CZE kokeita: 10 µM holo – tai apo-Tf ilman CBB G-250 (ylempi vihreä trace); ja seokset, joissa on 5 mM CBB G-250 väriaine 10 µM holo-Tf (lähi-blue trace) tai 10 µM apo-Tf (alempi punainen jälki).,
Perinteisesti elektroforeettisen liikkuvuuden proteiinin vapaa ratkaisu edustaa Henry yhtälö, kuten on esitetty yhtälössä (1):
Tässä, Q, n, R ja k edustaa net maksu, liuos viskositeetti, säde proteiinia, ja käänteinen Debye pituus elektrolyytti ratkaisu. Henryn funktio, H, kasvaa monotonisesti 2/3: sta 1: een., Tarkkaan ottaen tämä kaava pätee ainoastaan pallomainen molekyyli, jossa on centrosymmetric vastuussa jakelu, vaikka on olemassa joitakin keskusteluja muuttaa Henry yhtälö sovelletaan ei-pallomaisia proteiineja, monimutkaisia maksu jakelu (mukaan lukien dipoli ja quadrupole)26. Meidän tapauksessa, holo – ja apo-Tf molekyylit ovat epämuodostuneita aloilla hyvin samanlainen koko (muistuttaa spheroids kanssa pitkän ja lyhyen akselin pituudet noin 92 ja 60 Å (holo-Tf), ja 93 artiklan ja 68 Å (apo-Tf), vastaavasti) (Supplementary Fig. S9)., Lisäksi dipoli ja quadrupole odotetaan olevan vain vähäinen vaikutus liikkuvuuteen, koska CBB G-250 molekyylejä pakko holo-/apo-Tf ole lokalisoitu, kuten on esitetty Täydentävä Kuva. S9 (KS. jäljempänä). Kim et alin tarkkojen laskelmien tulokset.26 osoittavat, että elektroforeettinen liikkuvuus pallomaisia proteiini ei ole merkittävästi vaikuttaa quadrupole ratkaisuja alhaisen ionivahvuuden (I < 0.01 M), ja ionivahvuuden erottaminen puskuri meidän CZE kokeiluja oli myös alhainen (I = 0.013 M).,
Näin ollen, suhde elektroforeettiset liikkuvuudet apo – ja holo-Tf kompleksoida CBB G-250 väriaine (eli µApo/µHolo), johtuu suhde net maksut kunkin monimutkainen (eli QApo/QHolo), joka voidaan helposti peräisin Henry yhtälö. TF-CBB G-250-kompleksien negatiiviset nettokulut ovat pääasiassa peräisin väriaineen sitovasta määrästä. Näin ollen µApo / µholon arvo antaa myös väriaineiden lukumäärän suhteen (eli NApo / NHolo). Kokeellisesti, suhde elektroforeettiset liikkuvuudet kahta Tf (µApo/µHolo = (-2.69 × 10-4)/(-2.,09 × 10-4)) todettiin olevan CZE: n mukaan 1,29 (Kuva. 4), joka vastaa tehokkaan sähkövarauksen suhdetta, jos molempien Tf-muotojen koot ovat samanlaiset. Näin ollen elektroforeettisten mobiliteettien suhteen tulisi sopia sidottujen väriainemolekyylien suhteen. Kuitenkin, edelleen keskustelua suhdetta elektroforeettisen liikkuvuutta ja proteiinin muoto muiden metalloproteins tarvitaan silloin, kun holo – ja apo-proteiinin muodot eroavat toisistaan (kuten Cp).,
Molekyylien telakointi simulointi kokeiluja, tutkia molekyyli tunnustamista tilaa
Väriaine sitova määritettiin joustava molekyylien telakointi simulaatioita, joita AutoDock Vina27, jonka tarkoituksena on tyhjentävästi etsiä sitova sivustoja ja laskea niiden vapaiden energioiden (Fig. 5 ja täydentävä Kuva. S9). Äskettäin, Wang ym.25 ilmoitti, että AutoDock Vina on korkea pisteytys voima ja väli näytteenotto valtaa suhteessa muihin laajalti-käytetty telakka ohjelmia., Mukaan nämä simulaatiot, suurempi määrä CBB G-250 väriaine molekyylit pakko vapautunut Fe-sitova sivustoja apo-Tf verrattuna holo-Tf (Fig. 5a) havaittiin. Näiden pohjalta Autodock Vina simulaatioita, suhde väriaine-sitova numero NApo/NHolo oli 1.23, sitovan energiaa <-6.5 kcal/mol (vastaa K~104.4 M−1) (Fig. 5b varten väriaine-sitova numero kumulatiivinen taajuus jakelu funktiona sitova energiaa), joka on hyvässä sopusoinnussa meidän CZE tuloksia, keskusteltiin aiemmin (NApo/NHolo = 1.29)., Määrällinen sitova oletetaan lisäksi väriaine mM-tasoa (yli 95% sitova sivustoja vuorovaikutuksessa väriaine, kun log K on 4,4 tai suurempi), kuin näissä kokeissa.
sitovat määrä väriaine molekyylit holo-Tf oli myös tutkia CZE kokeiluja (tiedot eivät ole näkyvissä), niin katsotaan mistä vähentää vapaa väriaine huippu 1 mM CBB G-250 väriainetta näytteen kanssa ja ilman lisäksi 10 µM holo-Tf., Koska sitova numero mitattiin olevan >18, sitova määrä NHolo oletettiin olevan >20 MIKROFONIT-BN-SIVU kokeita (3.0 mM väriaine lisätty). Tämä sitova määrä väriaine molekyylit (>20) CZE kokeiluja on hyvä sopimus kanssa määrä sidottu väriaine molekyylit (N = 21) molekyylien telakointi simulaatiot, että aiheuttaisi ennustettu affiniteetti -6.5 kcal/mol, ja niin tulokset ovat itsestään johdonmukainen.,
Se on nähnyt näiden molekyylien telakointi simulaatioita ja CZE-kokeita, että CBB G-250 väriaine tunnistaa erilaisia kemiallisia rakenteita holo – ja apo-metalloproteins tuottaa eri µ-arvot. Tarkempia havaintoja simuloitu sitova tilat viittaavat myös siihen, että CBB G-250 molekyyli vuorovaikutuksessa aminohappo jäämiä saatavilla, koska enemmän auki (avattuna) apo-Tf rakenne verrattuna enemmän kiinni (taitettu) holo-Tf rakenne, kun väriaine osoittaa mitään sitovaa suoraan Fe-sitova aminohappotähdettä (Asp392, Tyr429, Tyr517 ja Hänen 585)., Näin, se on ymmärtää, että väriaine tunnistaa pieniä eroja taitettu ja avattuna kemialliset rakenteet metalloproteins, jotka ovat aiheuttama sitova tai dissosiaatio metalli-ioneja. Tällaisia pieniä eroja ei voida tunnistaa millään muulla tavanomaisella erotusmenetelmällä.
Aminohappo jäämiä yhteyttä värjäykseen molekyylin kunkin väriaine-sitova sivusto simulointi (esimerkiksi, Täydentävä Kuva. S10) oli ryhmitelty niiden hallitseva luonne: hydrofobinen, hydrofiilinen, tai sähköstaattinen varaus (kuin esitetty Täydentävä Taulukossa S2 ja Taulukko S3)., Tulosten mukaan väestön kunkin aminohapon vuorovaikutuksessa väriaine molekyylit osoitti mitään eroa holo – ja apo-proteiini muodostaa (26-27% ja hydrofobinen, 37-40 prosenttia hydrofiilinen, 33-35 prosenttia ladattu jäämiä jokainen lomake). Kuitenkin, määrä vety joukkovelkakirjoja apo-Tf (33 yhteensä; 1,2 prosenttia sitovia sivuston) oli merkittävästi suurempi kuin vuonna holo-Tf (19 yhteensä; 0,9 prosenttia sitovia sivuston). Kun keskitytään kahdeksan sitova sivustoja apo-Tf, jotka eivät ole läsnä holo-Tf (Täydentävä Taulukko S3), määrä S-joukkovelkakirjalainat per sivusto oli todettu 2.1., Nämä tulokset viittaavat vahvasti siihen, että muutokset vetysidos vuorovaikutus on ensisijaisesti vastuussa erottelu holo – ja apo-Tf muotoja, vaikka lisätutkimuksia tarvitaan ymmärtää täydellinen mekanismi.