mikä on RNA-seq?
RNA-seq (RNA-sekvensointi) on tekniikka, joka voi tutkia määrä ja sekvenssit RNA-näytteestä käyttäen seuraavan sukupolven sekvensointi (NGS). Se analysoi RNA: han koodattujen geenien ilmentymäkuvioiden transkriptomin. Tässä tarkastellaan, miksi RNA-seq on hyödyllinen, miten tekniikka toimii, ja perusprotokolla, jota käytetään yleisesti tänä1.
mitkä ovat RNA-seq: n sovellukset?,
RNA-seq avulla voimme tutkia ja löytää transcriptome, koko solun sisältö RNAs mukaan lukien mRNA, rRNA ja tRNA. Ymmärtäminen transcriptome on avainasemassa, jos haluamme liittää tiedot meidän genomin sen toiminnallinen proteiinien ilmentymistä. RNA-seq voi kertoa, mitkä geenit käynnistyvät solussa, mikä niiden ilmentymistaso on ja milloin ne aktivoituvat tai sulkeutuvat2. Näin tutkijat voivat syvemmin ymmärtää solun biologiaa ja arvioida muutoksia, jotka voivat viitata sairauteen., Joitakin suosituin tekniikoita, joka käyttää RNA-seq ovat transkription profilointi, SNP tunnistus, RNA: n muokkaus ja ero geenien ilmentyminen analysis3.
Tämä voi antaa tutkijoille tärkeää tietoa geenien. Esimerkiksi transkriptomi voi korostaa kaikkia kudoksia, joissa ilmaistaan tuntemattoman funktion geeni, joka saattaa kertoa, mikä sen rooli on. Se myös tallentaa tietoja vaihtoehtoisen silmukoinnin tapahtumia (Kuva 1), joka tuottaa eri selostukset yhden geenin sekvenssi. Näitä tapahtumia ei DNA-sekvensointi havaitsisi., Se voi myös tunnistaa mRNA-käsittelyn aikana tapahtuvia jälkitranscriptionaalisia muutoksia, kuten polyadenylaatiota ja 5′ cappingia2.
kuva 1: RNA-seq-aineistossa käytetään mRNA: ta, joka ei sisällä intronista koodaamatonta DNA: ta. Nämä lukemat on sitten linjattava takaisin referenssigenomiin.
miten RNA-seq vaikuttaa?
Varhainen RNA-seq tekniikoita käytetään Sanger sekvensointi teknologia, tekniikka, että vaikka innovatiivisten tuolloin oli myös matala-läpijuoksu, kalliita ja epätarkkoja., Se on vasta äskettäin kynnyksellä ja leviämisen NGS teknologian, emme voineet täysin hyödyntää RNA-seq on potential4.
tekniikan ensimmäisessä vaiheessa RNA: n populaatio muutetaan sekvensoitavaksi cDNA-fragmenteiksi (cDNA-kirjasto). Näin RNA voidaan laittaa NGS-työnkulkuun. Tämän jälkeen sirpaleiden jokaiseen päähän lisätään adapterit. Nämä sovittimet sisältävät toiminnallisia elementtejä, jotka mahdollistavat sekvensointi; esimerkiksi vahvistus tekijä ja ensisijainen sekvensointi-sivusto., Tämän jälkeen cDNA-kirjasto analysoidaan NGS: n avulla, jolloin syntyy lyhyitä sekvenssejä, jotka vastaavat fragmentin jompaakumpaa tai molempia päitä. Syvyys, johon kirjasto on sekvensoitu, vaihtelee riippuen tekniikoista, joihin tulostustietoa käytetään. Sekvensoinnissa noudatetaan usein joko yksilukuisia tai parilukuisia sekvensointimenetelmiä. Single-lue sekvensointi on halvempi ja nopeampi tekniikka (viite, noin 1% kustannuksista Sanger-sekvensointi), että sekvenssin ekspressio vain yksi pää, vaikka pariksi-end menetelmät järjestyksessä molemmista päistä, ja ovat siksi kalliimpia ja aika-consuming5,6.,
strand-spesifisten ja ei-strand-spesifisten protokollien välillä on tehtävä lisävalinta. Entinen menetelmä tarkoittaa tietoa, joka DNA-juosteen litteroitiin on säilytetty. Strand – spesifisistä protokollista saatujen lisätietojen arvo tekee niistä suotuisan vaihtoehdon.
Näitä lukee, joista tulee olemaan useita miljoonia loppuun mennessä työnkulun, voi sitten olla linjassa genomin viite ja kootaan tuottaa RNA-sekvenssi kartta, joka ulottuu transcriptome7.,
RNA-seq vs microarray: Miksi RNA-seq pidetään ylivoimainen
RNA-seq on laajalti pidetty ylivoimainen muihin teknologioihin, kuten microarray hybridisaatio. On olemassa useita syitä RNA-seq on hyvin pidetty tila
RNA-seq protocolExperiment Suunnittelu
Valmistelu ennen alkaen teidän RNA-seq kokeilu on välttämätöntä. Kysymyksiin, joihin kannattaa vastata ennen aloittamista, kuuluu:
•Mitä RNA: n puhdistusmenetelmää käytät?
•montako lukua tarvitset?
•mitä alustaa käytät?,
• * Mitä referenssigenomia käytät?
•Miten arvioit RNA: n laatua?
•* täytyykö sinun rikastuttaa kohde-RNA: ta?
•viivakoodaatko RNA: n?
•Onko minulla tarpeeksi biologisia ja teknisiä replikaatteja?
•Yksilukuinen vai parilukuinen sekvensointi?
cDNA Library Preparation
kun nämä kohdat on harkittu, voit aloittaa cDNA-kirjastosi valmistelun. Tämä edellyttää lisäämällä platform-specific ”- sovitin sekvenssit” ja monistaminen DNA: ta, mutta tarkka menettely on hyvin erityinen alustan käytetään tässä vaiheessa., Vahvistus DNA liittyy käänteiskopioijaentsyymin välittämän ensimmäisen juosteen synteesin jälkeen DNA-polymeraasi-välitteisen toisen lohkon synthesis10,11.
ekspressio Sekvensointi
Kun kirjasto on valmis, ja adapterit lisätty, voit käyttää valitsemasi sekvensointi alustan sekvenssi teidän cDNA-kirjastosta haluttuun syvyyteen. Kun transkriptiotietosi on tuotettu,voit kartoittaa tiedot referenssigenomiisi., Linjaus prosessi voi olla monimutkainen läsnäolo liitos variantteja ja muunnoksia, ja valinta viite genomin käyttää myös vaihdella miten vaikeaa tässä vaiheessa on. Starin kaltaiset ohjelmistopaketit ovat tässä vaiheessa hyödyllisiä, samoin Laadunvalvontatyökalut kuten Picard tai Qualimap12.
RNA-Seq Data-Analyysi
Kun linjaus vaiheessa, voit keskittyä analysoimiseen. Työkaluja, kuten Sailfish, RSEM ja BitSeq12 auttaa sinua määrittää oman ilmaisun tasoa, vaikka työkaluja, kuten MISO, joka määrittelee vaihtoehtoisesti saumattu geenit, ovat käytettävissä enemmän erikoistunut analysis13., On olemassa kirjasto näistä työkaluista siellä, ja lukeminen arvostelut ja roundups ovat paras tapa löytää oikea työkalu tutkimukseen.
yhteenvetona, moderni-päivä RNA-seq on vakiintunut niin ylivoimainen vaihtoehto microarray ja todennäköisesti pysyy suosittu vaihtoehto toistaiseksi.
5.https://systemsbiology.columbia.edu/genome-sequencing-defining-your-experiment
6.https://emea.illumina.com/science/technology/next-generation-sequencing/paired-end-vs-single-read-sequencing.html
9.https://cofactorgenomics.com/advantages-rna-seq-over-microarray-technology/
10.http://bioinformatics.ucdavis.edu/docs/2015-june-workshop/_downloads/Th_MB_RNASeq_Intro.pdf
11.https://rnaseq.uoregon.edu/#library-prep-stranded-libraries