naudan Sikiön seerumi (FBS) on nesteen osa hyytynyt veri sikiön vasikat, köyhdytettyä soluja, fibriinin ja hyytymistä tekijät, mutta sisältää suuren määrän ravitsemuksellisia ja makromolekyyliyhdisteisiin tekijät välttämättömiä solujen kasvua. Naudan seerumialbumiini on FBS: n pääkomponentti. FBS: n kasvutekijät ovat välttämättömiä viljeltyjen solujen ylläpitämiselle ja kasvulle . FBS sisältää myös erilaisia pieniä molekyylejä, kuten aminohappoja, sokereita, lipidejä ja hormoneja.
FBS: ää käytetään monenlaisissa sovelluksissa., Yksi tärkeimmistä käyttää FBS on aitotumallisilla solujen kulttuuria, jossa concentractions jopa 20% tai jopa korkeampi, jossa se tarjoaa monia välttämättömiä ravintoaineita ja kasvutekijöitä, jotka edistävät solujen eloonjäämistä ja lisääntymistä. Kuitenkin, se on tärkeää huomata, että FBS ihmisen soluviljelmissä voivat ottaa käyttöön tutkimus-esineitä; ihmisen soluja viljeltiin ihmisen sera käyttäytyä eri tavalla kuin ne viljellyt kanssa FBS ., FBS käytetään myös tutkimus -, valmistus ja valvonta ihmisten ja eläinten rokotteet ja biotech-lääkkeet, ja käytetään pysäyttämään trypsiini ruoansulatusta tai toimia protectant vuonna kylmäsäilytys . Soluviljelmät, joissa ei ole seerumia, ovat olleet käytössä jo vuosia. Sikiön naudan seerumi ei ehkä ole paras lisä soluviljelyyn. Esimerkiksi, naudan seerumin albumiini, jossa insuliini-transferriini-sodium selenite ja/tai epidermaalisen kasvutekijän kasvatusalustalle parantaa naudan alkioiden laatu ja trofoblasti-invaasio verrattuna naudan sikiön seerumia .
sikiön seerumi sisältää enemmän kasvutekijöitä ja sen gammaglobuliinipitoisuus (ts.vasta-aineet) on pienempi ja seerumi ei-sikiö. Nämä ovat tärkeitä, koska kasvutekijät helpottavat solujen selviytymistä ja proliferaatiota, kun vasta-aineet voivat sitoutua viljelmän soluihin. Lisäksi sikiön seerumissa on vähemmän komplementtiproteiineja (täydennyksiä) kuin aikuisilla tai vastasyntyneillä. Nämä täydennykset ovat ei-toivottuja vaikutuksia lysing solujen kulttuuri ja häiritsee immunomääritykset.
– Seerumi ja plasma ovat molemmat peräisin koko veren käyttämällä sentrifugointi poistaa komponentteja kuten punasoluja. Ero plasman ja seerumin on, että hyytyminen proteiineja ovat läsnä plasmassa, mutta on poistettu seerumin. Plasmaa valmistetaan yleensä lisäämällä antikoagulantteja vereen ennen sentrifugointia,mutta hyytymisproteiineja ei poisteta. Seerumi on valmistettu antamalla veren hyytyä ennen sentrifugointia tai laaja/progressiivinen sentrifugoimalla. Näin ollen fibrinogeenia ja hyytymiseen liittyviä proteiineja ei esiinny seerumissa.,
ihmisillä, seuraavat 22 proteiinit käsittävät 99% kaikista proteiinin pitoisuus seerumissa ja plasmassa: albumiini, yhteensä IgG -, transferriini -, fibrinogeeni -, kokonais-IgA, alfa-2-macroglobulin, yhteensä IgM -, alfa-1-antitrypsiini, C3 täydentää, haptoglobulin, alfa-1-glykoproteiiniin, apolipoproteiini-B, apolipoproteiini-A1, lipoproteiini (a), tekijä H, seruloplasmiini, C4 täydentää, komplementin tekijä B, pre-albumiini, C9 komplementin, Komplementti C1q, ja C8 täydentää . Loput 1% sisältää satoja proteiineja., Runsaimmat seerumin proteiini, albumiini, 50 mg/ml, käsittää noin puolet koko proteiini massa .
Kansainvälisen Seerumin Ry (ISIA; www.serumindustry.org), kauppa-organisaatio seerumin sijoittautuneet palveluntarjoajat, guidelines for quality valvonta standardization. Näissä ohjeissa edellytetään, että seuraavat testit suoritetaan käyttäen erityisiä menetelmiä, ja testitulosten on oltava saatavilla Analyysitodistuksena (Taulukko 1).,h>Testi
bakteerit ja sienet – hedelmättömyyttä testaus
mycoplasma
sytopaattisen agents – viruksen testaus
hemadsorbing agents – viruksen testaus
nauta-virus, ripuli – viruksen testaus
pH-mittaus
osmolaliteetti
yhteensä proteiinia, määräytyy Biuret-menetelmällä
end
hemoglobiini
elektroforeettiset kuvio
suorituskyvyn testaus, kuten kantasolujen kulttuuri
radial immunodiffusion
immunoglobuliini
gamma-glutamyyli-glukuronyylitransferaasin (GGT)
Taulukko 1., Seerumitestin vähimmäisvaatimukset.
Endotoksiinit, jota kutsutaan myös lipopolysakkaridi (LPS) tai lipooligosaccharide (LOS), tulee ulompi limakalvojen Gram-negatiiviset bakteerit, ja edistää kliinisiä ilmenemismuotoja eri patogeeniset Gram-negatiiviset bakteerit. In vivo endotoksiinit aiheuttavat kuumetta ja tulehdusvastetta, kun taas soluviljelmässä ne aiheuttavat soluvasteiden vaihtelua.
Endotoksiinipitoisuudet mitataan limulus amebocyte lysate (LAL) – testillä., Amebosyytit ovat verrattavissa selkärankaisten valkosoluihin ja LAL valmistetaan Limulus Polyphemuksen (amerikkalainen hevosenkenkärapu; Kuva 1) verestä. LAL on hyvin herkkä endotoksiinit ja hyytyy läsnä edes hetken verran endotoksiinin. Suojelutilanne Amerikkalainen hevosenkengän rapu on arvioitu ja käsitelty populaarikulttuurissa . Monet hevosenkenkärpäkannat ovat vaarassa, ja siksi niitä on suojeltava menetykseltä.
Me keskustelemme joitakin yleisesti käytetty erikoisuus sera alla. Seerumin valmisteet omistettu erityisiä tutkimusaiheita, kuten lipoprotein puutteellinen seerumia Kalen Biolääketieteen kolesteroli tutkimus , tai erikoistuneiden geenien ilmentyminen järjestelmissä, kuten tetrasykliini-turvatarkastus naudan sikiön seerumia , ei käsitellä.
Säännöllinen FBS sisältää runsaasti solunulkoisia vesikkeleitä, joista jotkut ovat eksosomit ., Kun suoritetaan eksosomien tutkimusta viljellyillä soluilla, on tärkeää käyttää FBS: ää ilman eksosomeja. On kuitenkin tärkeää olla tietoinen siitä, että eksosomivaje saattaa vaikuttaa solujen kasvuun ja tukea sitä eri tavalla kuin säännöllinen FBS . Exosome-köyhdytettyä FBS voidaan joko ostaa suoraan useita kaupallisia toimittajia, tai valmistettu joko ultrasentrifugointi-tai ultrasuodatus, vaikka vaikutukset ehtyminen prosesseja ja/tai kaupallisista lähteistä voi olla johdonmukainen kannalta solujen kasvua ja fysiologia .,
muut FBS: n komponentit voivat tyhjentyä kokeellisista vaatimuksista riippuen. Esimerkiksi Galmozzi A et al köyhdytti hemiä FBS: stä askorbiinihapolla .
yhteinen hoito FBS on lämpö-inaktivaatio, jossa FBS on lämmitetty vähintään 56°C: ssa 30 minuuttia vesihauteessa ajoittain ravistellen. Tarkoituksena on inaktivoida komplementtijärjestelmän komponentit FBS: ssä ja muut mahdolliset tuntemattomat solun kasvun estäjät., Aiemmin lämpö-inaktivaatio oli myös tarkoitus poistaa mycoplasma-kontaminaation, joka ei ole enää ongelma, koska kaikki seerumin tuotteet ovat nyt suodatetaan huokosten kokoa tarpeeksi pieni, poistaa mycoplasma. On huomattava, että lämmön inaktivoinnilla voi olla myös ei-toivottuja vaikutuksia, kuten viljeltyjen solujen kykyä kiinnittyä pintoihin .
useat toimittajat ovat kehottaneet käyttäjiä olemaan kuumentamatta FBS: ää useimpiin soluviljelmän tarpeisiin., Kussakin tapauksessa on suositeltavaa arvioida tarvetta lämpöä inaktivaatio tietyn sovelluksen, koska eri solut ovat erilaisia vastauksia kohti lämpöä-inaktivointi FBS .
Lisäksi, kuten kaikki muiden protokollien osalta FBS, lämpöä inaktivaatio prosessi on tehtävä varoen, koska lämpötila on liian korkea tai pitkäaikainen lämmitys on inaktivoida kasvun tekijät, ja luoda saostuu.
HY Pureskella et al yllä A431, HCC1569, MCF7, MDA-MB-231, MDA-MB-468, SCC25, SKBR3, T47D, RENCA ja CT26.WT-solulinjat väliaineissa, joissa on 10% (v/v) lämpöä inaktivoituja FBS-yhdisteitä ., Freeman SA et al käytti lämpö-inaktivoituja FBS koko niiden tutkimuksessa makrofageja . Aikawa T et al viljellyt hiiren ensisijainen glial soluja poly-D-lysiini–päällystetyt pullot DMEM, joka sisältää 10% heat-inaktivoitu FBS alkaen MilliporeSigma (F2442) . Feldman D et al viljellyt HEK293FT solujen DMEM täydennetty lämpö-inaktivoitua naudan sikiön seerumia Seradigm (97068-085), ja A549, HCT116, HT1080, A375 solujen lämpö-inaktivoitua naudan sikiön seerumia Sigma (F4135) arvioida optinen yhdistetyt näytöt ., Kulkarni S et al yllä Hut-78 solujen lämpö-inaktivoitua naudan sikiön seerumia Atlanta Biologicals .
aktiivihiili voi sitoutua lipofiilisten molekyylejä, ja näin on ollut tapana poistaa hormonit, kuten androgeenit, estradioli, progesteroni, kortisoli, testosteroni, trijodityroniinin (T3) ja tyroksiinin (T4) alkaen FBS. Nämä seerumin lipidihormonit häiritsevät yleensä immunomääritysjärjestelmiä ja insuliinimääritysmenetelmiä. L Zhao et al mitattiin kasvaimen solujen kasvua kulttuuri media täydennetty 10% hiili-riisuttu seerumin .,
Dialyysi voi poistaa kaikki molekyylejä, joiden molekyylipaino on alle 10 000 MW: n päässä FBS. Tämä sisältää sekä polaarisia että ei-polaarisia molekyylejä. Hormonit, sytokiinit, glukoosi, aminohapot ja monet muut poistetaan. Dialyysi poistaa myös antibiootit ja muut eksogeeniset molekyylit FBS: stä.
Dialyzed FBS alkaen Thermo Fisher Scientific käytettiin kulttuuri haiman duktaalinen adenokarsinooma varten SILAC massaspektrometrin tutkimus ja muut SILAC tutkimukset ja kulttuurin HeLa-solujen kanssa Tavannut analoginen l-AHA pulssi-chase click-kemian havaitseminen pitkäikäisiä proteiineja .,
Gamma-säteilytys voi olla osa prosessia steriloida FBS. FBS suodatetaan yleensä 0.1 um suodattimien läpi useita kertoja mikro-organismien poistamiseksi. Gammasäteilytys voi inaktivoida nautaeläimissä yleisesti esiintyviä viruksia. Jotkin viruslajit, kuten parvovirus, ovat kuitenkin vastustuskykyisiä gammasäteilylle.
vaikka FBS: n IgG-pitoisuus on melko alhainen, jopa tämä taso voi olla liian korkea joillekin tietyille sovelluksille. IgG-tasoa voidaan vähentää huomattavasti entisestään kaappauskromatografialla., FBS: ää, jossa IgG on alhainen, käytetään vasta-aineiden tuotantoon, rekombinanttiproteiinisynteesiin ja muihin sovelluksiin.
Kantasolujen kulttuuri on tiukat vaatimukset kasvun tekijöitä. Jotkin FBS: n kasvutekijät edistävät kantasolujen erilaistumista. Useat yritykset tarjoavat alkion kantasolujen pätevä FBS tarkoitus säilyttää erilaistumattomia kantasoluja. Kuitenkin, se on tärkeää testi erityisiä paljon FBS niiden sovellettavuus ylläpitämisessä pluripotency/totipotency eri tyyppisiä kantasoluja., Thermo Fisher tarjoaa alkion kantasolujen-pätevä FBS, kuten, esimerkiksi, käytetään E14TG2a hiiri ES cell culture Yasuda S et al .
suurimmat nautamaat ovat FBS: n pääasiallisia tarjoajia. Maita ovat Yhdysvallat, Australia, Uusi-Seelanti, Kanada, useita Etelä-ja Keski-Amerikassa.
valtion virastot säätelevät seerumituotteiden tuotantoa ja keruuta. FBS on merkitty USDA-luokan tai Euroopan-luokan., USDA-Luokan FBS voidaan tuoda osaksi mitä tahansa maan vapaa bse-taudin sekä suu-ja sairauksia, kun taas Euroopan-Luokan FBS voi olla myydään useimmissa Euroopan ja Aasian maissa.
FBS on parasta varastoida jäädytettynä, välillä -5–20°C, ja voi on sulanut lämpötilassa välillä 2-8°C. Se on usein hyödyllistä määräosaan ja jäädyttää seerumin pienempiä annoksia, usein 50 ml: n putket, välttää monia jäädyttää ja sulattaa syklit. Silloin tällöin osa FBS: n alikvoteista jää nesteeseen pakkasessa., Tämä johtuu puute nukleaatio center (hiukkasten) varten kiteytys (jäädyttäminen) aloittaa. Jos näpäytät putkia sormellasi, ne yleensä kiinteytyvät lähes välittömästi.
on tavallista, että sulamisen jälkeen on jonkin verran saostumaa. Se saostuu, todennäköisesti johtuu denaturointi joitakin seerumin proteiineihin, voi olla tyhjä lyhyt sentrifugointi, ja tämä ei yleensä vaikuta laatuun seerumin.
Monet toimittajat tarjoavat FBS eri laadut, alkuperämaa, ja hoito., FBS itsessään on monimutkainen seos, ja on odotettavissa vaihtelua eri laatujen, toimittajien ja erien välillä. Näin ollen on olennaisen tärkeää luoda prosessi, jolla valitaan ja arvioidaan RAHOITUSVAATIMUKSIA. Se on hyvä idea tutkia kirjallisuutta selvittää, miten erityisesti valinta FBS oli aiemmin käytetty vastaavaa tutkimusta, tai saman solun kulttuuri ja kiinnittää huomiota mahdollisiin paljon-to-paljon vaihtelua FBS. Auttaa tämän kanssa, Labome on tehnyt kyselyn FBS käyttö tieteellisiä julkaisuja, alla, auttaa kävijöitä valita sopivin FBS.,
Labome tutkimuksia kirjallisuuden materiaaleista. Tässä on yhteenveto julkaisuista, joissa viitattiin sikiön naudan seerumiin. Julkaisut ovat yli 10 000 julkaisun satunnainen osajoukko.
suurimpien toimittajien FBS ovat Life Technologies (nyt osa Thermo Fisher Scientific), Thermo Fisher Scientific Hyclone (nyt osa GE LifeScience), ja MilliporeSigma (Taulukko 2).
Life Technologies on globaali bioteknologiayritys, jonka pääkonttori sijaitsee Carlsbad, Kalifornia., Se on perustettu vuonna 2008 Invitrogen Corporationin ja Applied Biosystems Inc: n yhdistyessä. Monet heidän tuotteistaan ovat tuotenimellä Gibco. Ne tarjoavat soluviljelytuotteita, kuten soluviljelyainetta, FBS: ää ja muita asiaan liittyviä reagensseja. Yhtiö fuusioitui Thermo Fisher Scientificin kanssa vuonna 2014.
FBS Elämästä Teknologiaa on käytetty tutkimuksen nucleolus kuin vaihe-erotettu proteiini laadunvalvonta yksikkö HEK293T-ja HeLa-solut ., Pandolfini L et al viljellyt HEK293T-ja A549-solut DMEM täydennetty 10% Gibco FBS (10270-106) ja Bagle-2-solut Kotkan Minimum Essential Medium täydennetty 20% Gibco FBS (10270-106) . HEK293T-soluja ylläpidetään melko usein Thermo Fisherin 10-prosenttisella naudanseerumilla .
GE Healthcare Hyclone FBS on laajalti käytetty. De Cecco M et al käyttänyt sitä 15% ylläpitää senescent fibroblastien RK1, IMR-90 ja WI-38 Ham ’ s F-10 media ., Nicetto D et al käytetty Hyclone FBS (SH30071) lopettaa trypsiini ruoansulatusta ja ylläpitää alkion soluja . Kirkland C et al yllä HEK-293-solujen DMEM high-glukoosi GE Healthcare (SH30081.01), joka sisälsi 10% naudan, vasikan seerumin GE Healthcare (SH30072.03) .
Frohner IE et al yllä Neuro-2a (N2a) ja Cos-7-solujen American Type Culture Collection DMEM, joka sisältää 10% FBS alkaen Bovogen, Ranska . Kirkland C et al viljellyt U2OS soluja DMEM high-glukoosi, joka sisältää 10% tetracyclin-ilmainen naudan sikiön seerumia Wisent (081150) . Dong JX et al ylläpitää ensisijainen hippokampuksen kulttuurien Matrigel Corning 5% naudan sikiön seerumia Atlanta Biologicals (S11550) ., Lee A et al viljelty muriini c2c12 myoblastit DMEM täydennetty 10% sikiön naudan seerumi VWR (89510-186) . Zhao N et al viljellyt U2OS soluja ATCC (HTB-96) DMEM keskipitkän 10% (v/v) naudan sikiön seerumia Altas Biologicals . Liu X et al viljelty hiiren 4T1 solujen DMEMsupplemented 10% naudan sikiön seerumia Biochrom .