a 16S rRNS gént filogenetikai vizsgálatokhoz használják, mivel a különböző baktériumfajok és az archaea között erősen konzerválódik. Carl Woese (1977) úttörő szerepet játszott a 16S rRNA használatában. Javasolt, hogy a 16S rRNA gén megbízható molekuláris óraként használható, mivel a távoli rokon bakteriális vonalokból származó 16S rRNS szekvenciák hasonló funkciókkal rendelkeznek. Néhány termofil archaea (pl. termoproteálok rendje) 16S rRNA gén intront tartalmaz, amelyek erősen konzervált régiókban helyezkednek el, és hatással lehetnek az “univerzális” primerek lágyítására., A mitokondriális és kloroplasztikus rRNS is felerősödik.
a leggyakoribb alapozó párt weisburg et al. (1991) és jelenleg 27F-nek és 1492r-nek nevezik; egyes alkalmazásokhoz azonban rövidebb amplikonokra lehet szükség, például 454 titánkémiai szekvenáláshoz a 27F-534R alapozó pár, amely v1-V3.Gyakran 8F helyett 27F. a két alapozó szinte azonos, de 27F van egy M helyett C. AGAGTTGATCMTGGCTCAG képest 8F.,
| szekvencia (5′-3′) | Ref.,td> | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| 805R | GAC TAC CAG GGT ATC TAA TC | ||||
| 533F | GTG CCA GCM GCC GCG GTA A | ||||
| 518R | GTA TTA CCG CGG CTG CTG G | ||||
| 1492R | CGG TTA CCT TGT TAC GAC TT |
PCR and NGS applicationsEdit
In addition to highly conserved primer binding sites, 16S rRNA gene sequences contain hypervariable regions that can provide species-specific signature sequences useful for identification of bacteria.,Ennek eredményeként a 16S rRNA génszekvenálás elterjedt az orvosi mikrobiológiában, mint a bakteriális azonosítás fenotípusos módszereinek gyors és olcsó alternatívája. Bár eredetileg a baktériumok azonosítására használták, a 16S szekvenálást később úgy találták, hogy képes a baktériumokat teljesen új fajokba sorolni, vagy akár genera.It olyan új fajok leírására is használták, amelyeket soha nem sikerült tenyészteni.,A harmadik generációs szekvenálás sok laboratóriumba érkezik, órákon belül több ezer 16S rRNS szekvencia egyidejű azonosítása lehetséges, lehetővé téve a metagenomikus vizsgálatokat, például a bélflórát.
Hypervariable regionsEdit
a bakteriális 16S gén kilenc hypervariable régiót (V1–V9) tartalmaz, amelyek körülbelül 30-100 bázispár hosszúak, amelyek részt vesznek a kis riboszomális alegység másodlagos szerkezetében., A megőrzés mértéke nagymértékben változik a hiperváltoztatható régiók között, a konzerváltabb régiók korrelálnak a magasabb szintű taxonómiával, a kevésbé konzervált régiók pedig alacsonyabb szintekkel, például nemzetséggel és fajokkal. Míg a teljes 16S szekvencia lehetővé teszi az összes hipervariálható régió összehasonlítását, körülbelül 1500 bázispár hosszúságánál megfizethetetlenül drága lehet a különböző bakteriális közösségek azonosítására vagy jellemzésére irányuló tanulmányok számára., Ezek a tanulmányok általában az Illumina platformot használják, amely 50-szeres, 12 000-szer olcsóbb, mint az 454 pyrosequencing, illetve a Sanger szekvenálás. Bár olcsóbb és mélyebb közösségi lefedettséget tesz lehetővé, az Illumina szekvenálás csak 75-250 bázispár hosszú (Illumina MiSeq-val akár 300 bázispár), és nincs kidolgozott protokollja a teljes gén megbízható összeállítására a közösségi mintákban. A teljes hypervariable régiók egyetlen Illumina futásból összeállíthatók, azonban ideális célpontokká teszik őket a platform számára.,
míg a 16S hipervariálható régiók drámaian változhatnak a baktériumok között, a 16S gén egésze nagyobb hosszúságú homogenitást tart fenn, mint eukarióta megfelelője (18S riboszomális RNS), ami megkönnyítheti az igazításokat. Ezenkívül a 16S gén erősen konzervált szekvenciákat tartalmaz a hiperváltozható régiók között, lehetővé téve olyan univerzális alapozók kialakítását, amelyek megbízhatóan előállíthatják a 16S szekvencia ugyanazon szakaszait a különböző taxonok között. Bár egyetlen hipervariálható régió sem képes pontosan osztályozni az összes baktériumot doménről fajra, egyesek megbízhatóan megjósolhatják a specifikus taxonómiai szinteket., Számos közösségi tanulmány ezért olyan félig konzervált hipervariálható régiókat választ ki, mint például a V4, mivel a phylum szintjén olyan pontosan képes felbontást biztosítani, mint a teljes 16S gén. Míg a kevésbé konzervált régiók küzdenek az új fajok osztályozásával, amikor a magasabb rendű taxonómia ismeretlen, gyakran használják őket specifikus kórokozók jelenlétének kimutatására. Egy tanulmány szerint Chakravorty et al. 2007–ben a szerzők különböző kórokozók V1-V8 régióit jellemezték annak meghatározása érdekében, hogy mely hipervariálható régiók lennének a leghasznosabbak a betegségspecifikus és széles körű vizsgálatokhoz., Többek között megállapítások, megjegyezték, hogy a V3 régió legjobb azonosítása a nemzetség minden vizsgált kórokozók, valamint, hogy a V6-os volt a legpontosabb a különbséget a fajok között CDC-néztem kórokozók vizsgálni, beleértve a lépfene.
míg a 16S hypervariable region analysis hatékony eszköz a bakteriális taxonómiai vizsgálatok, küzd, hogy különbséget szorosan kapcsolódó fajok. Az Enterobacteriaceae, Clostridiaceae és Peptostreptocaceae családokban a fajok akár 99% – os szekvencia-hasonlóságot mutathatnak a teljes 16S génben., Ennek eredményeként a V4 szekvenciák csak néhány nukleotiddal különbözhetnek, így a referencia-adatbázisok nem képesek megbízhatóan osztályozni ezeket a baktériumokat alacsonyabb rendszertani szinteken. A 16S analízisnek a hiperváltozható régiók kiválasztására való korlátozásával ezek a vizsgálatok nem tudják megfigyelni a szorosan kapcsolódó taxonok különbségeit, és egyetlen taxonómiai egységekbe csoportosítják őket, ezért alábecsülik a minta Teljes sokféleségét. Ezenkívül a baktérium genomjai több 16S gént is tartalmazhatnak, a V1, V2 és V6 régiók pedig a legnagyobb fajon belüli sokféleséget tartalmazzák., Bár nem a legpontosabb módszer a baktériumfajok osztályozására, a hipervariálható régiók elemzése továbbra is az egyik leghasznosabb eszköz a bakteriális közösségi vizsgálatok számára.