magzati szarvasmarha-szérum (FBS) a magzati borjakból származó, sejtekből, fibrinből és véralvadási faktorokból származó alvadt vér folyékony frakciója, de számos, a sejtek növekedéséhez nélkülözhetetlen tápanyag-és makromolekuláris tényezőt tartalmaz. A szarvasmarha szérum albumin az FBS fő összetevője. Az FBS növekedési faktorai elengedhetetlenek a tenyésztett sejtek fenntartásához és növekedéséhez . Az FBS számos apró molekulát is tartalmaz, például aminosavakat, cukrokat, lipideket és hormonokat.
az FBS-t számos alkalmazásban használják., Az FBS egyik elsődleges felhasználása az eukarióta sejtkultúrában van, ahol a koncentrációk akár 20% – kal vagy még magasabbak is lehetnek, ahol számos alapvető tápanyagot és növekedési tényezőt biztosít, amelyek megkönnyítik a sejtek túlélését és proliferációját. Fontos azonban megjegyezni, hogy az FBS az emberi sejtkultúrákban kutatási tárgyakat vezethet be; az emberi szérummal tenyésztett emberi sejtek eltérően viselkednek az FBS-szel tenyésztettektől ., Az FBS-t az emberi és állatgyógyászati vakcinák, valamint a biotechnológiai gyógyszerek kutatásában, gyártásában és ellenőrzésében is használják, valamint a tripszin emésztésének megállítására vagy a krioprezerváció védelmezőjeként szolgálnak . A szérum nélküli sejttenyészetet évek óta használják. Lehet, hogy a magzati szarvasmarha szérum nem a legjobb kiegészítő a sejttenyészet számára. Például a szarvasmarha – szérum albumin inzulin-transzferrin-nátrium-szelenittel és / vagy epidermális növekedési faktorral a tenyészközegben javítja a szarvasmarha embrió minőségét és trofoblaszt invázióját a magzati szarvasmarhák szérumához képest .
a magzati szérum több növekedési faktort tartalmaz, alacsonyabb gamma-globulin (azaz antitestek) tartalommal és nem magzati szérummal rendelkezik. Ezek azért fontosak, mert a növekedési faktorok elősegítik a sejtek túlélését és proliferációját, míg az antitestek a tenyészet sejtjeihez kötődhetnek. Ezenkívül a magzati szérum alacsonyabb komplementfehérjéket (kiegészítőket) tartalmaz, mint a felnőttek vagy az újszülöttek. Ezeknek a kiegészítőknek a tenyészetben a lizing sejtek nemkívánatos hatásai vannak, és zavarják az immunoassay-ket.
a szérum és a plazma egyaránt teljes vérből származik centrifugálással a vörösvértesteket is tartalmazó komponensek eltávolítására. A plazma és a szérum közötti különbség az, hogy a véralvadási fehérjék jelen vannak a plazmában, de eltávolításra kerültek a szérumból. A plazmát általában úgy állítják elő, hogy a centrifugálás előtt véralvadásgátló szereket adnak a vérhez, de az alvadási fehérjéket nem távolítják el. A szérumot úgy állítják elő, hogy lehetővé teszik a vér koagulációját centrifugálás előtt vagy kiterjedt/progresszív centrifugálással. Így a fibrinogén és a véralvadáshoz kapcsolódó fehérjék nincsenek jelen a szérumban.,
Az emberek, a következő 22 fehérjék alkotják 99% – a a teljes fehérje tartalom, a szérum s-plazma: albumin, teljes IgG, transzferrin, fibrinogén, teljes IgA, alfa-2-macroglobulin, teljes IgM, alfa-1-antitripszin, C3 kiegészítik, haptoglobulin, alfa-1-savas glikoprotein, apolipoprotein-B, apolipoprotein-A1, lipoprotein (a) tényező H, ismert, C4 kiegészítik, komplement faktor B, pre-albumin, C9 kiegészíti, A C1q kiegészítik, illetve C8 kiegészítik . A fennmaradó 1% több száz fehérjét tartalmaz., A legelterjedtebb szérumfehérje, az albumin 50 mg/ml-en, a teljes fehérjetömeg körülbelül felét tartalmazza .
the International Serum Industry Association (ISIA; www.serumindustry.org), a szérum szolgáltatók kereskedelmi szervezete, iránymutatásokat hozott létre a minőség-ellenőrzési szabványosításhoz. Ezek az iránymutatások előírják, hogy a következő vizsgálatokat speciális módszertanokkal kell elvégezni, és a vizsgálati eredményeknek rendelkezésre kell állniuk az analitikai bizonyítványként (1.táblázat).,h>Teszt
baktériumok, gombák – sterilitás vizsgálat
mycoplasma
citopatogén ügynökök – vírus vizsgálat
hemadsorbing ügynökök – vírus vizsgálat
szarvasmarha-hasmenés vírus fertőző vizsgálati
pH-mérés
ozmolalitás
a teljes fehérje határozza meg a Biuret-módszer
endotoxin
hemoglobin
elektroforetikus minta
teljesítmény-vizsgálat, például őssejt-kultúra
radiális immunodiffusion
immunglobulin
gamma-glutamil-transzferáz (GGT)
1. Táblázat., Minimális szérumvizsgálati követelmények.
endotoxinok, más néven lipopoliszacharid (LPS) vagy lipooligoszacharid (LOS), Gram-negatív baktériumok külső membránjaiból származnak, és hozzájárulnak számos patogén Gram-negatív baktérium klinikai megnyilvánulásához. In vivo az endotoxinok lázat és gyulladásos reakciót váltanak ki, míg sejttenyészetben a sejtválaszok variációját mutatják be.
az Endotoxinszintet a limulus amebocita Lizát (lal) teszttel mérik., Az amebociták hasonlóak a gerincesek fehérvérsejtjeihez, a LAL pedig a Limulus polyphemus (Amerikai patkó rák; 1.ábra) véréből készül. A LAL nagyon érzékeny az endotoxinokra és koagulál, még egy perc mennyiségű endotoxin jelenlétében is. Az amerikai patkósrák természetvédelmi helyzetét a populáris kultúrában értékelték és vitatták meg . A Patkós rákok sok populációja veszélyben van, ezért ügyelni kell arra, hogy megvédjék őket a veszteségtől.
az alábbiakban néhány általánosan használt speciális szérumot tárgyalunk. A specifikus kutatási témákra szánt szérumkészítményeket, például a Kalen Biomedical lipoprotein-hiányos szérumát a koleszterinkutatáshoz vagy a speciális génexpressziós rendszerekhez,például a tetraciklin-szűrt magzati szarvasmarha-szérumhoz, nem tárgyalják.
a rendszeres FBS nagyszámú extracelluláris vezikulumot tartalmaz, amelyek közül néhány exoszóma ., A tenyésztett sejtekkel végzett exoszómás kutatás során kritikus az FBS használata exoszómák nélkül. Fontos azonban tudatában lenni annak, hogy az exoszóma által kimerült FBS a szokásos FBS-ektől eltérően befolyásolhatja és támogathatja a sejtek növekedését . Az exoszóma-kimerült FBS közvetlenül több kereskedelmi szállítótól vásárolható meg, vagy ultracentrifugálással vagy ultraszűréssel készíthető el, bár a kimerülési folyamatok és / vagy a kereskedelmi források hatásai nem feltétlenül konzisztensek a sejtek növekedése és fiziológiája szempontjából .,
az FBS egyéb összetevői kimeríthetők, a kísérleti követelményektől függően. Például, Galmozzi a et Al kimerült hem származó FBS aszkorbinsavval .
az FBS közös kezelése a hő-inaktiválás, ahol az FBS-t 56°C-on 30 percig melegítik vízfürdőben, alkalmanként rázva. A cél az, hogy inaktiválják a komplement rendszer bármely összetevőjét az FBS-ben, valamint a sejtnövekedés egyéb lehetséges ismeretlen inhibitorait., Korábban a hő-inaktiválást a mycoplasma szennyeződésének eltávolítására is szánták, ami már nem jelent problémát, mivel az összes szérumterméket a mycoplasma eltávolításához elég kicsi pórusméreteken szűrjük át. Meg kell jegyezni, hogy a hő-inaktiválásnak nemkívánatos hatásai is lehetnek, például a tenyésztett sejtek képességének csökkentése a felületekhez való csatlakozáshoz .
Több szállító sürgette a felhasználókat, hogy ne melegítsék-inaktiválják az FBS-t a legtöbb sejttenyésztési igényhez., Minden esetben tanácsos értékelni a hő inaktiválásának szükségességét egy adott alkalmazásban, mivel a különböző sejtek eltérő válaszokat adnak az FBS hő-inaktiválására .
továbbá, mint minden más, az FBS-re vonatkozó protokoll, a hő inaktiválási folyamatot óvatosan kell elvégezni, mivel a túl magas vagy hosszan tartó fűtés inaktiválja a növekedési faktorokat, és csapadék keletkezik.
HJK et al-a431, HCC1569, MCF7, MDA-MB-231, MDA-MB-468, SCC25, SKBR3, T47D, RENCA és CT26.WT sejtvonalak közegben 10% (v/v) hő-inaktivált FBS ., Freeman SA et al használt hő-inaktivált FBS egész tanulmányukban makrofágok . Aikawa T et al tenyésztett egér primer gliális sejtek poli-D–lizin bevonatú lombikok DMEM tartalmazó 10% hő-inaktivált FBS származó MilliporeSigma (F2442) . Feldman D et al tenyésztett HEK293FT sejtek DMEM kiegészítve hő-inaktivált magzati szarvasmarha szérum Seradigm (97068-085), valamint A549, HCT116, HT1080, a375 sejtek hő-inaktivált magzati szarvasmarha szérum Sigma (F4135), hogy értékelje optikai összevont képernyők ., Kulkarni s et al fenntartotta Hut-78 sejtek hő-inaktivált magzati szarvasmarha szérum Atlanta Biologicals .
az aktív szén kötődhet a lipofil molekulákhoz, ezért olyan hormonok, mint az androgén, az ösztradiol, a progeszteron, a kortizol, a tesztoszteron, a triiodotironin (T3) és a tiroxin (T4) eltávolítására használták az FBS-ből. Ezek a szérum lipid hormonok általában befolyásolják az immunoassay rendszereket és az inzulinvizsgálati módszereket. L Zhao et al mért tumorsejtek növekedését a tenyészetben média kiegészítve 10% szénnel megfosztott szérum .,
a dialízis az összes molekulatömeget 10 000 MW-nál kisebb molekulatömeggel távolíthatja el az FBS-ből. Ez magában foglalja mind a poláris, mind a nem poláris molekulákat. A hormonokat, citokineket, glükózt, aminosavakat stb. A dialízis eltávolítja az antibiotikumokat és más exogén molekulákat is az FBS-ben.
a Thermo Fisher Scientific Dialized FBS-t a hasnyálmirigy ductalis adenocarcinoma tenyészetében használták a SILAC tömegspekciós és más SILAC-vizsgálatokhoz , valamint a hosszú élettartamú fehérjék klikk-kémiai kimutatására szolgáló, Met analóg L-AHA impulzusvadászattal rendelkező HeLa sejtek tenyészetében .,
a Gamma-besugárzás része lehet az FBS sterilizálásának. Az FBS-t általában 0,1 um szűrőkön keresztül szűrjük többször a mikroorganizmusok kiküszöbölése érdekében. A Gamma-besugárzás inaktiválhatja a szarvasmarhafélékben általában jelen lévő vírusokat. Néhány vírusfaj, például a parvovírus azonban ellenáll a gamma-besugárzásnak.
bár az FBS meglehetősen alacsony IgG tartalommal rendelkezik, még ez a szint is túl magas lehet bizonyos alkalmazásokhoz. Az IgG szint jelentősen csökkenthető tovább a capture kromatográfiával., Az alacsony IgG-vel rendelkező FBS-t antitest-termelésre, rekombináns fehérjeszintézisre és egyéb alkalmazásokra alkalmazzák.
az Őssejtkultúrának szigorú követelményei vannak a növekedési faktorok tekintetében. Az FBS-ben jelen lévő növekedési tényezők közül néhány elősegíti az őssejtek differenciálódását. Számos vállalat kínál embrionális őssejt minősített FBS célja, hogy fenntartsák differenciálatlan őssejt. Fontos azonban, hogy a különböző típusú őssejtek pluripotenciájának/totipotenciájának fenntartásában való alkalmazhatóságuk érdekében bizonyos mennyiségű FBS-t teszteljünk., A Thermo Fisher embrionális őssejtminősítésű FBS-t biztosít, mint például az e14tg2a egér ES sejtkultúrájában Yasuda s et al .
a főbb szarvasmarha-országok az FBS fő szolgáltatói. Az országok közé tartozik az Egyesült Államok, Ausztrália, Új-Zéland, Kanada, több Dél-és Közép-Amerikában.
a szérumtermékek gyártását és gyűjtését kormányzati szervek szabályozzák. Az FBS-t USDA-fokozatú vagy európai szintű címkével látják el., Az USDA-fokozatú FBS bármely országba importálható, amely mentes a szarvasmarhák szivacsos agyvelőbántalmától és a száj-és körömfájástól, míg az európai szintű FBS-t a legtöbb európai és ázsiai országban lehet értékesíteni.
FBS a legjobb tárolt fagyasztott között -5, hogy a -20°C-on, majd felengedett közötti hőmérsékleten 2-8°C. gyakran hasznos aliquot befagyott a szérum kisebb adagokban, gyakran 50 ml-es csövekhez, hogy elkerülje a sok fagy, majd olvadás ciklusok. Időnként néhány FBS aliquot folyadékban marad fagyasztási hőmérsékleten., Ez annak köszönhető, hogy nincs nukleációs központ (részecske) a kristályosodás (fagyasztás) megkezdéséhez. Ha egyszerűen az ujjával mozgatja a csöveket, általában szinte azonnal megszilárdulnak.
gyakori, hogy felolvasztás után némi csapadék van. A csapadék, valószínűleg a szérumfehérjék némelyikének denaturálása miatt, rövid centrifugálással tisztítható, ami általában nem befolyásolja a szérum minőségét.
sok beszállító különböző minőségű FBS-t, származási országot és kezelést biztosít., Maga az FBS összetett keverék, és a különböző fokozatok, beszállítók és tételek közötti változékonyságra kell számítani. Ezért elengedhetetlen az FBS kiválasztásának és értékelésének folyamata. Jó ötlet megvizsgálni az irodalmat annak meghatározására, hogy az FBS egy adott kiválasztását korábban hogyan használták hasonló kutatásokban, vagy ugyanazon sejttenyészetben, és hogy nagy figyelmet fordítsanak az FBS lehetséges lot-to-lot variációjára. Ennek elősegítése érdekében a Labome felmérést végzett az FBS használatáról az alábbiakban tárgyalt tudományos publikációkból, hogy segítsük látogatóinkat a legmegfelelőbb FBS kiválasztásában.,
Labome felmérések irodalom a felhasznált anyagok. Itt összefoglalják a magzati szarvasmarha-szérumot idéző kiadványokat. A kiadványok egy véletlenszerű részhalmaza több mint 10.000 kiadványok.
az FBS fő beszállítói A Life Technologies (jelenleg a Thermo Fisher Scientific része), a Thermo Fisher Scientific Hyclone (jelenleg a GE LifeScience része) és a MilliporeSigma (2.táblázat).
A Life Technologies egy globális biotechnológiai vállalat, amelynek székhelye a kaliforniai Carlsbadban található., 2008-ban alakult az Invitrogen Corporation és az Applied Biosystems Inc.egyesülésével. Sok termékük Gibco márkanév alatt van. Sejttenyészet-termékeket, például sejttenyészet-közeget, FBS-t és egyéb releváns reagenseket biztosítanak. A cég 2014-ben egyesült a Thermo Fisher Scientific céggel.
A Life Technologies FBS-jét a nukleolus fázistól elválasztott fehérje minőségellenőrző entitásként történő tanulmányozására használták a HEK293T és a HeLa sejtekben ., Pandolfini L et al cultured HEK293T és A549 sejtek DMEM kiegészítve 10% Gibco FBS (10270-106) és Caco-2 sejtek Eagle minimális alapvető közegben kiegészítve 20% Gibco FBS (10270-106) . A HEK293T sejteket gyakran tartják fenn a Thermo Fisher 10% – os magzati szarvasmarha-szérumával .
GE Healthcare Hyclone FBS széles körben használják. De Cecco M et al 15% – ban használta az LF1, IMR-90 és WI-38 szeneszcens fibroblasztok fenntartásához a Ham F-10 közegében ., A Nicetto D et al a Hyclone FBS-t (SH30071) használta a tripszin emésztésének megszüntetésére és az embrionális sejtek fenntartására . Laflamme C et al fenntartotta a GE Healthcare (SH30081.01) DMEM magas glükóztartalmú HEK-293 sejtjeit, amelyek 10% szarvasmarha borjúszérumot tartalmaznak a GE Healthcare-ből (SH30072.03) .
Frohner IE et al karbantartott Neuro – 2a (N2a) és Cos-7 sejtek az amerikai típusú TENYÉSZETGYŰJTEMÉNYBŐL a DMEM-ben, amely 10% FBS-t tartalmaz Bovogen-ből, Franciaország . Laflamme C et al tenyésztett U2OS sejtek DMEM magas glükóz tartalmú 10% tetraciklin-mentes magzati szarvasmarha szérum Wisent (081150). Dong JX et al fenntartotta az elsődleges hippocampális tenyészeteket a Matrigel-en a Corning-tól 5% magzati szarvasmarha-szérummal az Atlanta Biologicals-től (S11550) ., Lee A et al tenyésztett murine c2c12 MYOBLASTOK DMEM kiegészítve 10% magzati szarvasmarha szérum VWR (89510-186). Zhao N et al tenyésztett U2OS sejtek ATCC (HTB-96) DMEM közegben 10% (v/v) magzati szarvasmarha szérum Altas Biologicals . Liu X et al termesztett murine 4T1 sejtek Dmemsuppented 10% magzati szarvasmarha szérum Biochrom .