Differenciál, hogy a migráció a holo – s apo-metalloproteins által MIKROFON-BN-OLDAL
Amíg nem szétválasztás holo- (Fe2-transzferrin (Tf)) pedig apo-Tf volt megfigyelhető a hagyományos 1D natív (CBB G-250 ingyenes)-OLDAL (Fig. 1a) és SDS-oldal (ábra., 1b), érdekes módon, azt találtuk, hogy holo – és apo-Tf teljesen elválasztjuk útján MIC-BN-oldal (ábra. 1c) (meg kell jegyezni, hogy két sávot figyeltek meg egy “tiszta” apo-TF minta esetében, BN-oldal nélkül, MIC mód nélkül, fém ionszennyezés miatt; kiegészítő ábra. S1). Az SDS-PAGE-ben ez valószínűleg az erős denaturáló körülmények között előforduló holo-formákból származó fémionok disszociációjának köszönhető14, 15 (az adatok nem jelennek meg). Ez a tény arra utal, hogy a holo – és apo-formák közötti elektroforetikus felismerés nem áll rendelkezésre a hagyományos OLDALMÓDSZEREKHEZ., Ezek az eredmények arra utalnak, hogy bizonyos gyenge denaturáló szerek, mint például a MIC-BN-PAGE-ben alkalmazott CBB – G 250, felismerik a különbséget a holo-és az apo-metalloproteinek között a szétválasztás fokozása érdekében, a fém disszociáció elkerülése mellett.
a Különböző migrációs magatartások a holo – s apo-formák is megfigyelhető ismert (Cp) kötött Cu2+ (Cu-Cp), valamint a szuperoxid-dismutase (SOD) kötött Cu2+, illetve a Zn2+ (Cu/Zn-SOD) a MIKROFON-BN-OLDAL módszer (Fig. 1d, e). Apo-formák vándoroltak pozíciók szoros összhangban a pontos molekulatömeg MIC-BN-PAGE (ábra., 1: Tf, 77 kDa; Cp, 134 kDa; SOD, 32 kDa), ami hasznos a fehérjék azonosításakor. A bevezető részben leírtak szerint ezek az eredmények arra késztettek bennünket, hogy kidolgozzuk a holo/apo konverzió (HAC)-2D MIC-BN-oldal módszertant a holo-metalloproteinek szelektív izolálására.
koncepció holo / apo átalakítás 2D MIC-BN-PAGE
az új 2D oldal módszer alapján a differenciál migráció között holo-és apo-metalloproteins, kezdődik MIC-BN-PAGE szakaszban végzett két sáv (sávok A és B ábra., (2) I. panel) a holo – és apo-metalloproteinek elválasztásának lehetővé tétele a két metalloprotein formát tartalmazó mintából. A két sávot ezután két különböző kezelésnek vetik alá a kezdeti MIC-BN-oldal elválasztás után: az a sávot egy második MIC-BN-oldal szakasznak vetik alá, de csak holo / apo konverziós kezelés után (ábra. 2 panel II-1); míg a B sávot egy fémérzékelő oldal szakaszba szállítják, hogy meghatározzák az elválasztott fehérjékhez kapcsolódó fémionokat (ábra. 2 panel II-2). A B sávra alkalmazott kezelést korábban validálták., Például néhány nehézfémion (Cu2+, Fe3+, Co3+, Ni2+, Mn2+ és Cd2+) meghatározása kis térfogatú (µL) mintákban ppt és Sub-ppb szinteken ezen az oldalon végzett módszerrel, tiszta helyiség használata nélkül21. Továbbá ez a tandem 1D MIC-BN-PAGE / metal detection page módszertan feltárta a CU2+ pontos eloszlását az emberi szérumban még a gyengén albuminhoz kötött (cserélhető) Cu2+ 21 esetében is, és azt javasolta, hogy a periplasmikus Rubrivax gelatinosus CopI protein, amely nagymértékben részt vesz a rézrezisztenciában, rézkötő protein22., Mégis, a fémkötésű fehérjék komplex fehérjemintában történő teljes azonosítása nehéz az Együtt vándorló fehérjék miatt. Például nem bizonyították teljes mértékben, hogy a CopI R. gelatinosusban rézkötő fehérje, bár szekvenciájának három feltételezett Cu-kötőhelye van: (i) egy 1-es típusú rézközpont, amely számos cupredoxinban, például azurinban és plastocianinban, (ii) hisztidinben gazdag N-terminus szekvenciában és (iii) hisztidinben/metioninban gazdag szekvenciában van jelen. A CopI-rel kapcsolatos fehérjék sok baktériumban jelen vannak, de nem széles körben konzerváltak; például hiányzik az Escherichia coli22-ből., Eddig csak az R. gelatinosus és a Vibrio cholerae fehérjéit vizsgálták, és részt vettek a Cu rezisztenciában22, 23. R. gelatinosusban a CopI fehérje erősen expresszálódik Cu2 + jelenlétében; a Cu-méregtelenítő mechanizmus azonban még nem ismert. Így szükség van a metalloproteinek izolálására a komplex biológiai mintákban együtt létező összes többi fehérjéből.
a HAC-2D MIC-BN-PAGE/metal detection page módszertan fogalma., I. Panel: 1D MIC-BN-oldal két sávon. Az a sávot gélen belüli holo / apo konverziós eljárásnak vetették alá (mint a II-1.panelen), majd az a sávot 2D MIC-BN-PAGE-nek vetették alá a holo/apo átalakítás után (mint a III. panelen). A B sávot Cu2 + és Fe3 + észlelési oldalnak vetették alá (mint a II-2.panelen). A 2D electropherogram egy keverék metalloproteins (holo-Tf, apo-Tf, holo-Cp, illetve holo-SOD), amely holo-metalloproteins az eredeti minta volt elszigetelt, mint foltok le az átlós vonal (a szaggatott sárga vonal a Panel III.). Az elektroferogramok teljes méretű változatai az ábrán láthatók., Az 2 ábrán látható. S2.
e korlátozás leküzdése érdekében a B sáv 1D MIC-BN-PAGE/metal detection page elemzése által szolgáltatott információkat a Holo/apo konverzió után a MIC-BN-PAGE második dimenziójának alávetik. Ennek az elemzésnek a végrehajtásához az a sávot először savas, fém kelátképző oldatban áztatják (lásd a módszerek szakaszt és a részletes feltételeket) a holo / apo konverzióhoz (ábra. 2 panel II-1)., Ennek során a holo-metalloproteineket fémmentes apo-metalloproteinekké alakítják az első oldal dimenziójának gélében. A kezelt a sávot ezután fémmentes agarózgél segítségével eljuttatják a második MIC-BN-oldal szakaszba (lásd a kiegészítő információkat). A második MIC-BN-PAGE szakaszban (ábra. 2, III. panel), az eredeti mintából származó apo-metalloproteinek és nem-metalloproteinek az átlós vonalon vándorolnak, mivel ezeknek a fajoknak a második oldal dimenziójában történő vándorlása teljesen megegyezik az első oldal dimenziójában történő migrációjukkal., Másrészt az eredeti mintából származó holo-metalloproteinek az első és a második MIC-BN-oldal dimenzióiban különböző távolságra vándorolnak, mivel ezek a fehérjék holo-formájukként vándorolnak az első dimenzióban, apo-formájukként a második dimenzióban (és mivel a MIC-BN-PAGE a metalloproteinek holo – és apo-formáinak eltérő elektroforetikus mobilitását eredményezi; a vide infra). Így csak az eredeti mintából származó holo-metalloproteinek vándorolnak ki az átlós vonalról a második dimenzióban, amelyet MALDI-TOF MS azonosíthat további fehérjetisztítás nélkül., Az eredeti mintaoldatban a metalloproteinekhez kötött fémionok típusai és mennyisége (az átlós foltokként izolált) a B sáv fémérzékelő oldalával határozható meg, a fent leírtak szerint. Ezért a metalloprotein fajok azonosítására és eloszlására vonatkozó információk, valamint az általuk összekapcsolt fémionok azonossága és koncentrációja az új HAC-2D MIC-BN-PAGE/metal detection page módszertanból érhetők el.,
Szelektív elszigeteltség, metalloproteins a MAB-2D MIKROFON-BN-OLDAL
A proof-of-concept, HAC-2D MIKROFON-BN-OLDAL/fémérzékelő OLDAL igazolta a mintát tartalmazó keverék holo-Tf, apo-Tf, holo-Cp, illetve holo-GYEP fehérje szabványok (ami a 2D electropherogram Fig. 2, III. panel), valamint egy emberi szérumminta (kiegészítő ábra. S3). A Holo-metalloproteinek foltjait, amelyek az átlós vonalról vándoroltak, sikeresen megfigyelték a vegyes fehérje mintában., Ezenkívül a Fe3+-t a holo-TF, a Cu2+-t pedig a holo-CP és a holo-SOD pozícióiban észlelték, az első MIC-BN oldalú szakaszban, fémérzékelő oldal használatával. Ha nem történik holo / apo konverzió, akkor az összes fehérje átlós vonalon vándorol (kiegészítő ábra. S5). Humán szérumminta esetében a holo-TF és a holo-CP-t sikeresen detektálták (kiegészítő ábra. S3)., Így arra a következtetésre jutottak, hogy a HAC-2D MIC-BN-PAGE/metal detection PAGE nagyon hatékony a holo-metalloproteinek izolálására és az eredetileg metalloproteinekhez kötött fémionok azonosítására egy fehérje keverékben.
végül a HAC-2D MIC-BN-PAGE módszert alkalmazták az R. gelatinosus sejtekből nyert összes bakteriális oldható fehérje frakcióra, amelyet 1, 2 mM Cu2+ jelenlétében termesztettek, CopI fehérjét expresszálva. Ez egy biológiai fehérje mintát képvisel., Ehhez a mintához 100 kDa, illetve 29 kDa helyzetben az átlós vonaltól távol eső helyet találtak az első, illetve a második oldalon (2.ábra). 3a). A Cu2 + magas koncentrációját az első MIC-BN-oldal 97-139 kDa helyzetében figyelték meg (ábra. 3b). Következésképpen arra a következtetésre jutottak, hogy a fehérje ezen a helyen cu-ion kötődik hozzá. A foltot levágták, majd később MALDI-TOF MS. Copi-nak megfelelő peptideket azonosítottak (ábra. 3C, kiegészítő ábra. S7 és S1 táblázat)., Ezen túlmenően, amikor ezt a gélfoltot SDS-PAGE-en futtatták, egyetlen Copi fehérje sávot figyeltek meg (az adatok nem jelennek meg). Az átlós vonal másik pontját 40 kDa körül figyelték meg (a második dimenzió 29 kDa CopI pontja felett (ábra. 3a)). A MALDI-TOF MS megerősítette, hogy ez a folt a CopI-ból is származik (valószínűleg a molekulatömeg szerint a CopI dimerje). Így egy metalloprotein kifejezetten izolálható egy komplex fehérje keverékből, miközben azonosítja a kötött fémét is., A HAC – 2D MIC-BN-PAGE elemzése egyértelműen bebizonyította, hogy a CopI egy rézkötő fehérje, és érdekes módon ez a tulajdonság összefügghet a fehérje Cu-méregtelenítő funkciójával a bakteriális periplazmában. További kvantitatív elemzés kimutatta a Cu-ion és a CopI Sztoichiometriáját 1:1 arányban (a CBB R-250 festéssel meghatározott kötött Cu-ion (1,05 µM) és a holo-CopI protein (0,95 µM) koncentrációi alapján). Ez teljes mértékben egyetért más kísérleti eredményekkel, amelyek CU-t találtak: CopI sztoichiometria 1:1.2 az ICP-MS használatával tiszta CopI-val (Durand et al.,, publikálatlan adatok). Ez az eredmény azt sugallja, hogy módszerünk hasznos a metalloprotein sztoichiometriák vizsgálatára is.
HAC-2D MIC-BN-oldal, ezüstfestéssel (a), Cu2+ detection PAGE (b), az r-ből nyert oldható frakcióból. 1,2 mm CU2+ (teljes fehérje: 31,5 µg) jelenlétében termesztett zselatinos sejtek. Az a) pontban a csillag által jelzett, átlósan elhelyezkedő foltot MALDI-TOF MS-nek vetették alá (kiegészítő ábra., S7), a CopI Érett szekvencia (c) részeként a piros betűtípussal megjelenített szekvenciák azonosítása. Az elektroferogramok teljes méretű változatai az ábrán láthatók. 3 vannak ábrázolva kiegészítő ábra. S8.
kapilláris elektroforézis kísérletek molekuláris felismerési módok vizsgálatára
a Holo – és apo-formák közötti felbontás javítása MIC-PAGE-ben, CBB festékkel (1.ábra)., Az 1C-e) módszertanunk fontos kulcsa, és érdekes módon ez a molekuláris felismerés úgy tűnik, hogy különböző számú CBB G-250 festékmolekulából származik, amelyek kötődnek a metalloproteinek holo-vs. apo-formáihoz. Ez viszont valószínűleg különböző hatékony töltéseket és/vagy indukált szterinszerkezeteket eredményez a festék-fehérje komplexek esetében. Mindkét hatás hatással lenne az elektroforetikus mobilitásra., A CBB g-250 festék Holo – és apo-TF-hez való kötődésének felismerési mechanizmusára vonatkozó mélyebb betekintés érdekében CE kísérleteket végeztek, valamint dokkolási szimulációkat végeztek az AutoDock Vina program24, 25 (vide infra) segítségével. A cze-t szabad vizes oldatban végezzük gél mátrix nélkül, ezért a szimulációkban nem kell figyelembe venni a molekuláris szitáló hatást. A cze által mért holo-TF elektroforetikus mobilitása nyilvánvalóan különbözött az apo-Tf-től a CBB festék hozzáadásával (ábra. 4), míg ezek a fehérjék azonos mozgékonysággal rendelkeztek a festék hiányában., Ez a tény erősen arra utal, hogy a holo – és apo-metalloproteinekhez kötött festékmolekulák száma eltérő. A cze-ben a fehérje-festék komplex migrációját túlnyomórészt a komplex hatékony töltése befolyásolja, amelyet viszont a fehérjéhez kötött, egyenként töltött anionos CBB festékmolekulák száma befolyásolna.,
cze kísérletekből származó tipikus elektroferogramok: 10 µM holo – vagy apo-Tf CBB G-250 nélkül (felső zöld nyom); és 5 mm CBB g-250 festéket tartalmazó keverékek 10 µm Holo-TF-vel (középkék nyom) vagy 10 µm apo-tf-vel (alsó piros nyom).,
Hagyományosan, az elektroforetikus mobilitás egy fehérje ingyenes megoldás képviseli a Henry egyenlet, amint azt az egyenlet (1):
Itt, Q, η, R, meg k képviselik a nettó felelős az oldat viszkozitása, a sugár, a fehérje -, valamint az inverz Debye hossza elektrolit oldat. A Henry funkció, H, monoton módon növekszik 2/3-ról 1-re., Szigorúan véve ez a képlet érvényes, kizárólag egy gömb alakú molekula egy centrosymmetric szétosztást, bár vannak viták, hogy módosítsa a Henry egyenlet alkalmazni kell a nem gömb alakú fehérjék komplex szétosztást (beleértve a dipól, valamint quadrupole)26. Esetünkben a holo-és apo-TF molekulák nagyon hasonló méretű deformált gömbök (körülbelül 92, illetve 60 Å (holo-TF), illetve 93 és 68 Å (apo-Tf) hosszú és rövid tengelyhosszúságú gömbök) (kiegészítő ábra. S9)., Ezenkívül a dipólus és a kvadrupol várhatóan csak kismértékben befolyásolja a mobilitást, mivel a CBB g-250 molekulák, amelyek a holo-/apo-TF-hez kötődnek, nem lokalizálódnak, amint azt a kiegészítő ábra mutatja. S9 (lásd alább). A pontos számítások eredményei Kim et al.A 26.ábra azt mutatja, hogy a szferoid fehérje elektroforetikus mobilitását nem befolyásolja szignifikánsan egy quadrupol alacsony Ionos szilárdságú oldatokban (i < 0,01 M), és a szétválasztási puffer Ionos ereje a CZE kísérleteinkben hasonlóan alacsony volt (i = 0,013 M).,
így a CBB G – 250 festékkel (nevezetesen µApo/µHolo) komplex apo-és holo-TF elektroforetikus mobilitásainak aránya az egyes komplexek (nevezetesen a QApo/QHolo) nettó töltéseinek arányához kapcsolódik, amely könnyen levezethető a Henry-egyenletből. A TF-CBB G-250 komplexek negatív nettó töltései elsősorban a festék kötési számából származnak. Következésképpen a µApo/µHolo értéke a festékszámok arányát is adja (nevezetesen NApo/NHolo). Kísérletileg a TF két formájának elektroforetikus mobilitásának aránya (µApo / µHolo = (-2.69 × 10-4)/(-2.,09 × 10-4)) cze (ábra. 4), amely megfelel a hatékony elektromos töltés arányának, feltéve, hogy a Tf mindkét formájának mérete hasonló. Ezért az elektroforetikus mobilitások arányának meg kell egyeznie a kötött festékmolekulák arányával. Az elektroforetikus mobilitás és más metalloproteinek fehérjeformája közötti kapcsolat további megvitatására azonban szükség van olyan esetekben, amikor a holo – és apo-fehérje formák különböznek (mint a Cp esetében).,
molekuláris dokkolási szimulációs kísérletek molekuláris felismerési módok vizsgálatára
a Festékkötést az AutoDock Vina27 rugalmas molekuláris dokkolási szimulációi határozták meg, amelyek célja a kötőhelyek kimerítő keresése és szabad energiáik kiszámítása (1.ábra). 5 és kiegészítő ábra. S9). Nemrég, Wang et al.25 számolt be, hogy AutoDock Vina egy nagy pontozási teljesítmény és közbenső mintavételi teljesítmény képest más széles körben használt dokkoló programok., E szimulációk szerint a CBB g-250 festékmolekulák nagyobb számban kötődnek az Apo-TF üres Fe-kötőhelyeihez, mint a holo-TF (ábra). 5A) megfigyelték. Ezen Autodock Vina szimulációk alapján a NApo / NHolo festékkötő szám aránya 1,23 volt, kötési energiája <-6,5 kcal / mol (ami k~104,4 M−1-nek felel meg) (ábra. 5b A festékkötő szám kumulatív frekvenciaeloszlása a kötési energia függvényében), amely jó egyetértésben van a korábban tárgyalt CZE eredményeinkkel (NApo/NHolo = 1.29)., Kvantitatív kötődés feltételezhető a festék hozzáadásával mM-es szinten (a kötőhelyek több mint 95% – a kölcsönhatásba lép a festékkel, ha a K log 4,4 vagy annál nagyobb), mint ezekben a kísérletekben.
A kötelező száma festék molekulák holo-Tf is megvizsgálták által JÚNIUS kísérletek (az adatok nem jelennek meg), mint megítélni a csökkenés ingyenes festék csúcs egy 1 mM-es CBB G-250 festék minta nélkül a mellett a 10 µM holo-Tf., Mivel a kötési számot >18-ra mértük, az NHolo kötési számát 20-nak feltételezték a MIC-BN-PAGE kísérletekben (3, 0 mM festék hozzáadásával). Ezt a kötelező száma festék molekulák (>20) a JÚNIUS kísérletek jó megállapodást a száma köteles a festék molekulák (N = 21) a molekuláris dokkolási szimulációk, ami alkalmat ad arra, hogy előre affinitás, -6.5 kcal/mol, így az eredmények önálló következetes.,
ezekből a molekuláris dokkolási szimulációkból és CZE kísérletekből kiderül, hogy a CBB G-250 festék felismeri a holo – és apo-metalloproteinek különböző kémiai struktúráit, így különböző µ értékeket ad. Részletes észrevételek a szimulált kötelező módok is arra utalnak, hogy a CBB G-250 molekula együttműködik aminósav elérhető miatt a nyitottabb (hajtogatás nélkül) apo-Tf szerkezet képest zártabb (hajtogatott) holo-Tf szerkezete, míg a festék nem mutatja kötelező közvetlenül a Fe-kötelező aminósav (Asp392, Tyr429, Tyr517 Az 585)., Így feltételezhető, hogy a festék felismeri a fémionok kötése vagy disszociációja által kiváltott metalloproteinek hajtogatott és kibontott kémiai szerkezete közötti kis különbségeket. Az ilyen kis különbségek nem azonosíthatók más hagyományos elválasztási módszerekkel.
a szimulációban a festékmolekulával érintkező aminosavmaradékok a festékkötés minden egyes helyén (például kiegészítő ábra). Az S10-et domináns jellegük szerint osztályozták: hidrofób, hidrofil vagy elektrosztatikus töltés (az S2 kiegészítő táblázatban és az S3 táblázatban foglaltak szerint)., Az eredmények szerint a festékmolekulákkal kölcsönhatásba lépő minden aminosav-típus populációi nem mutattak különbséget a holo – és apo-fehérje formák között (26-27% hidrofób, 37-40% hidrofil, 33-35% a töltött maradványok esetében minden formában). Az Apo-Tf-ben a hidrogénkötések száma (összesen 33; kötőhelyenként 1,2) szignifikánsan nagyobb volt, mint a holo-TF-ben (összesen 19; kötőhelyenként 0,9). Amikor az apo-Tf nyolc olyan kötőhelyére összpontosítottunk, amelyek nem voltak jelen a holo-TF-ben (S3 kiegészítő táblázat), a H-kötések számát helyenként 2.1-nek találták., Ezek az eredmények erősen arra utalnak, hogy a hidrogénkötési kölcsönhatások változásai elsősorban a holo – és apo-TF formák megkülönböztetéséért felelősek, míg a teljes mechanizmus megértéséhez további vizsgálatokra lenne szükség.