mi az RNS-seq?a
RNS-seq (RNS-szekvenálás) egy olyan technika, amely a következő generációs szekvenálással (NGS) vizsgálhatja a mintában lévő RNS mennyiségét és szekvenciáit. Elemzi az RNS-ben kódolt génexpressziós minták transzkriptómáját. Itt megnézzük, hogy miért hasznos az RNS-seq, hogyan működik a technika, valamint az alapvető protokoll, amelyet ma általánosan használnak1.
milyen alkalmazásai vannak az RNS-seq-nak?,
RNS-seq lehetővé teszi számunkra, hogy megvizsgáljuk és felfedezzük a transzkriptómát, az RNS-ek teljes celluláris tartalmát, beleértve az mRNS-t, az rRNA-t és a tRNS-t. A transzkriptóma megértése kulcsfontosságú, ha összekapcsoljuk a genomra vonatkozó információkat a funkcionális fehérje expressziójával. Az RNS-seq meg tudja mondani, hogy mely gének vannak bekapcsolva egy sejtben, milyen expressziós szintjük van, és mikor aktiválódnak vagy leállnak2. Ez lehetővé teszi a tudósok számára, hogy mélyebben megértsék a sejt biológiáját, és felmérjék a betegségre utaló változásokat., Az RNS-seq-t használó legnépszerűbb technikák közé tartozik a transzkripciós profilozás, az SNP-azonosítás, az RNS-szerkesztés és a differenciál génexpresszió elemzése3.
ez létfontosságú információkat adhat a kutatóknak a gének működéséről. Például a transzkriptóma kiemelheti azokat a szöveteket, amelyekben ismeretlen funkciójú gén expresszálódik, ami jelezheti, hogy mi a szerepe. Azt is rögzíti információkat alternatív splicing események (ábra 1), amelyek különböző átiratok egyetlen gén szekvencia. Ezeket az eseményeket DNS-szekvenálás nem veszi fel., Azonosítja az mRNS-feldolgozás során előforduló, transzkripciós módosításokat is, mint például a poliadenilezés és az 5′ capping2.
1. ábra: az RNS-seq adatok az mRNS rövid olvasatát használják, amely mentes az intronikus nem kódoló DNS-től. Ezeket az olvasásokat ezután vissza kell igazítani a referencia genomhoz.
hogyan fejti ki hatását az RNS-seq?
a korai RNS-seq technikák Sanger szekvenálási technológiát alkalmaztak, amely technika, bár akkoriban innovatív volt, szintén alacsony áteresztőképességű, költséges és pontatlan., Csak a közelmúltban, az NGS technológia megjelenésével és elterjedésével sikerült teljes mértékben kihasználni az RNS-seq potenciálját4.
a technika első lépése az RNS populációjának cDNA-fragmensekké (cDNA-könyvtár) történő konvertálása. Ez lehetővé teszi, hogy az RNS egy NGS munkafolyamatba kerüljön. Ezután adaptereket adnak a töredékek mindkét végéhez. Ezek az adapterek olyan funkcionális elemeket tartalmaznak, amelyek lehetővé teszik a szekvenálást; például az erősítőelemet és az elsődleges szekvenálási helyet., A cDNA könyvtár ezután elemezzük NGS, termelő rövid szekvenciák, amelyek megfelelnek az egyik vagy mindkét végén a fragmentum. A mélység, amelyre a könyvtár szekvenált függően változik technikák, amelyek a kimeneti adatok fogják használni. A szekvenálás gyakran követi az egy olvasható vagy párosított végű szekvenálási módszereket. A Single-read szekvenálás egy olcsóbb és gyorsabb technika (referenciaként a Sanger szekvenálás költségeinek körülbelül 1%-át), amely a cDNA-t csak az egyik végéből szekvenciálja, míg a párosított végű módszerek sorrendje mindkét végről,ezért drágábbak és időigényesek5, 6.,
további választást kell tenni a szálspecifikus és a nem szálspecifikus protokollok között. A korábbi módszer azt jelenti, hogy megmarad az információ arról, hogy melyik DNS-szálat átírták. A szálspecifikus protokollokból nyert extra információk értéke kedvező lehetőséget biztosít számukra.
Ezek olvas, ami nem lesz sok millió végére a munkafolyamat, akkor kell beállítani, hogy a genom referencia majd össze, hogy készítsen egy RNS szekvencia térkép, amely felöleli a transcriptome7.,
RNS-seq vs microarrays: miért tekintik az RNS-seq-t jobbnak
RNS-seq-nak, széles körben úgy tekintik, mint más technológiák, például a mikroarray hibridizáció. Számos oka van annak, hogy az RNS-seq jól átgondolt státusza
egy RNS-seq protocolExperiment Planning
előkészítése az RNS-seq kísérlet megkezdése előtt elengedhetetlen. Az include10 megkezdése előtt megválaszolandó kérdések:
* milyen RNS-tisztítási módszert használ?
* hány olvasásra lesz szüksége?
* melyik platformot fogja használni?,
* milyen referencia genomot fog használni?
* hogyan értékeli az RNS minőségét?
•meg kell gazdagítania a cél RNS-t?
•vonalkódolja az RNS-t?
* van elég biológiai és technikai replikációm?
•Egyolvasós vagy párosított végű szekvenálás?
cDNA Library Preparation
miután ezeket a pontokat figyelembe vették, elkezdheti a cDNA könyvtár előkészítését. Ehhez hozzá kell adni a platformspecifikus “adapterszekvenciákat” és fel kell erősíteni a DNS-t, de a pontos eljárás nagyon specifikus lesz az ebben a szakaszban használt platformra., A DNS amplifikációja reverz transzkriptáz által közvetített első szál szintézist foglal magában,amelyet egy DNS-polimeráz által közvetített második szál szintetizál10, 11.
cDNA szekvenálás
a könyvtár elkészítése és az adapterek hozzáadása után a kiválasztott szekvenálási platform segítségével a cDNA könyvtárat a kívánt mélységbe állíthatja. Miután elkészítette az átirat adatait, leképezheti az adatokat a referencia genomjára., Az igazítási folyamatot nehezítheti az illesztési változatok és módosítások jelenléte, és az alkalmazott referencia-Genom kiválasztása is változik, hogy milyen nehéz ez a szakasz. Az olyan szoftvercsomagok, mint a STAR, ebben a szakaszban hasznosak, csakúgy, mint a minőség-ellenőrzési eszközök, mint a Picard vagy a Qualimap12.
RNS-Seq Adatelemzés
az igazítási szakasz után az adatok elemzésére összpontosíthat. Az olyan eszközök, mint a Sailfish, az RSEM és a BitSeq12, segítenek számszerűsíteni a kifejezési szinteket, míg az olyan eszközök, mint a MISO, amely számszerűsíti az alternatív módon összekapcsolt géneket, rendelkezésre állnak a speciálisabb elemzésekhez13., Van egy könyvtár ezen eszközök odakinn, és olvasás vélemények, roundups a legjobb módja annak, hogy megtalálják a megfelelő eszköz a kutatás.
összefoglalva, a mai RNS-seq jól megalapozott, mint a mikroarrays jobb lehetősége, és valószínűleg továbbra is az előnyben részesített lehetőség egyelőre.
5.https://systemsbiology.columbia.edu/genome-sequencing-defining-your-experiment
6.https://emea.illumina.com/science/technology/next-generation-sequencing/paired-end-vs-single-read-sequencing.html
9.https://cofactorgenomics.com/advantages-rna-seq-over-microarray-technology/
10.http://bioinformatics.ucdavis.edu/docs/2015-june-workshop/_downloads/Th_MB_RNASeq_Intro.pdf
11.https://rnaseq.uoregon.edu/#library-prep-stranded-libraries