Állatok
Minden kísérletet végeztek el a nem-tenyésztő férfi, mind a női C57/B6 egerek (2-3 hónapos). Minden szex hozzájárult a teljes állatszám nagyjából feléhez minden kísérletben. Az állatokat 12/12 órás sötét / világos ciklusban szállásolták el, és korlátlan hozzáférést biztosítottak az élelmiszerekhez és a vízhez., Az egerek használata ezekben a kísérletekben összhangban volt a laboratóriumi állatok gondozására és használatára vonatkozó útmutatóval, valamint a kísérleti protokollokat a Dél-Kaliforniai Egyetem intézményi állatgondozási és Felhasználási Bizottsága (IACUC) hagyta jóvá.
fény expozíció
a szemeket 0,5% tropikamid szemészeti oldattal, USP (AKORN) és 2,5% fenilefrin-hidroklorid szemészeti oldattal, USP (AKORN) hígították. Az egerek egyik napról a másikra sötétekké váltak., Sötétségben tartották őket, vagy diffúz, hűvös fehér fluoreszkáló fénynek voltak kitéve 5000 lux lumineszcenciaszinten, 30 perctől 1 óráig, mielőtt eutanizálták volna. A sötétre adaptált mintákat mindkét módszerhez egy sötétkamrában készítették infravörös fény alatt, és minden, sötétre adaptált szövetet érintő eljárást infravörös konverterekkel felszerelt boncoló mikroszkóppal (B. E. Meyers & Co, Inc.). A fénynek kitett mintákat boncoló hatály alatt dolgozták fel a szoba fényében.,
Retina disszekció
az egereket izoflurán belégzéssel, majd nyaki diszlokációval eutanizálták. A szemeket enukleálták, a retinákat pedig egy 35 × 10 mm-es petri-csészében izolálták, amelyet az alábbiakban leírt megfelelő puffer/oldat töltött. Mindkét szemből eltávolították a szaruhártyát, a lencsét és az üvegtestet, valamint a retina pigmentált epitéliumát (rpe) és a sclera-t. Az izolált retinákat egy 60 × 15 mm-es edényben egy tollas szikével szegélyezték, a széleket pedig két téglalapra vágták., Az egyes felére csökkent retina görbületének minimalizálása segíti a retina simítását, és biztosítja a retina rétegek pontos héját. A retina hajtogatott széleinek megfelelő vágása elengedhetetlen: ha a retina lehajtható élekkel rendelkezik, amikor a szűrőpapírra kerül, akkor az izolált ROS hozamának csökkenéséhez vezet, és ami még fontosabb, más retina rétegekkel szennyezett lesz.
Immunocitokémia
az enukleáció előtt a szaruhártya felső pólusát kauterizáció jellemezte, majd a szaruhártyát, a lencsét és az üvegtestet eltávolították., A fennmaradó szempoharakat 4% paraformaldehidbe helyeztük PBS-ben 15 percig, majd 3-szor öblítettük 10 percig PBS-ben. A szempoharakat 30% – os szacharózban, PBS-ben 2 órán át krioprotektáltuk, Tissue-Teck® O. C. T. vegyületbe (Sakura Finetek, USA) helyeztük, majd gyorsan lefagyasztottuk folyékony N2-ben. A fagyasztott blokkokat 10 µm-en kriosztátban (CM 3050 S, Leica Microsystems) osztottuk fel, majd -80 °C-on tároltuk.az antitest inkubálása előtt a szekciókat 15 percig szobahőmérsékletűre (RT) igazítottuk., A GNAT1 festés segítségével a TF-15 egér monoklonális antitest, epitope letöltése végzett: a szakaszok kezeltek 2 perc RT 0.02 mg/ml proteináz K blokkoló pufferben (2% bovin szérum albumin, 2% kecske szérum, 0.3% Triton X-100 1X PBS), valamint fűtött, 65 °C 10 s követi öt öblítés a PBS. Blokkoló pufferben volt akkor alkalmazzák, hogy minden szakasz 1 h. Szakaszok vagy inkubáljuk a nyúl elleni antitest ARR1 (C10C10 hígított 1:100 blokkoló pufferben), vagy a TF-15 (CytoSignal, hígított 1:200 blokkoló pufferben)., A szekciókat fluoreszceinnel jelölt másodlagos antitestekkel (Vektorlaboratóriumok) öblítették és inkubálták. Ezután az összes szekciót kétszer megfestették a rhodopsin elleni biotinilált antitesttel (1D4 hígítva 1:300 blokkoló pufferben). A szekciókat rodamin avidin D-vel (1:100, Vektor laboratóriumok) öblítették és inkubálták. A képeket Zeiss AxioPlan2 mikroszkóppal szereztük be. A világos és sötét állapotokat azonos expozíciós idő alkalmazásával örökítették meg.,
ros gyűjtemény szekvenciális peeling szűrőpapírral
a szűrőpapír-peeling módszert egy technikából adaptálták, hogy fluoreszcens címkével ellátott bipoláris sejteket mutassanak be egy retina lapos tartóban patch bilincs felvételekhez . A fotoreceptor sejt több rétegének szűrőpapírral történő eltávolítása fokozatosan kiteszi a bipoláris sejt dendriteket és sejttesteket, hogy könnyebben hozzáférhessenek az elektromos stimulációhoz és a tapaszrögzítő leolvasásokhoz. Megállapítottuk, hogy a hámozott melléktermékek, a szűrőpapírra ragasztott fotoreceptor rétegek alkalmasak voltak a későbbi Western blot elemzésekre.,
az Ames táptalajt az élő retina szövet manipulálására használták (Sigma-Aldrich a1420). Két különböző puffer készült: Ames ‘- HEPES (1 L hozzá 2,38 g HEPES, 0,877 g NaCl, pH 7,4) és Ames ‘ – bikarbonát (1 L hozzá 1,9 g NaHCO3, pH 7,4). Mindkettőt előre elkészítettük, steril szűrtük, 4 °C-on tároltuk., A retina disszekció előtt 50-100 mL Ames-HEPES-T 100% O2-vel buborékoltunk egy GibcoTM 100 mL-es adathordozó palackban (Thermo Fisher, USA), és 50-100 mL Ames-bikarbonátot 95% O2-vel és 5% CO2-t buborékoltunk egy könnyű-szoros tartályban 15-20 percig használat előtt.
A retinákat a “Retina disszekció” szakaszban leírtak szerint készítették, és egy könnyű, szoros tartályban, Ames-bikarbonáttal, 95% O2-vel és 5% CO2-vel buborékolva tárolták a fiziológiai pH fenntartása érdekében., Ez az inkubációs állapot megegyezik azzal , amelyet a retina fiziológusai az ex vivo elektroretinogram felvételekhez vagy szívóelektród felvételekhez használnak, és több órán keresztül képes fenntartani a szövetek életképességét és funkcionalitását. Minden egyes peeling eljáráshoz felére csökkent téglalap alakú vágott retina darabot használtunk. A szövetet egy 1,7 mL-es műanyag átviteli pipettával (csúcsvágással) egy 35 × 10 mm-es petri-edénybe továbbítottuk, amely oxigénezett Ames-HEPES-t tartalmaz. A Média 10 percenként frissült a peeling folyamat során, hogy fenntartsa az oxigénezett állapotot., Az oldatban lévő retina a fotoreceptor oldalával lefelé irányult csipesszel és az átviteli pipettel. Egy 5 mm × 2,5 mm-es téglalap alakú szűrőpapírt VWR 413-as fokozatú szűrőpapírból vágtak (átmérő 5,5 cm, pórusméret 5 µm, VWR, USA) a retina melletti petri-edénybe. A retinát csipesszel (enyhén tartva a széleket) óvatosan mozgatták a szűrőpapírra a fotoreceptor oldalával lefelé. Miután a retina a szűrőpapírra összpontosult, mindkettőt óvatosan kiemelték az Ames-HEPES-ből., A szűrőpapír alsó oldalát (a retina nélküli oldalt) papírtörlőre foltolták, hogy felszívja a folyadékot a szűrőpapíron (2-3 tampon). Ez biztonságos tapadást eredményezett a fotoreceptor sejtek és a szűrőpapír rostjai között, és ez a kötődés fontos volt a ROS réteg eltávolításához. A Petri-csészéből egy csepp Ames-HEPES került a retinára, a szűrőpapír pedig ismét a papírtörlőre foltosodott. Ezt összesen háromszor megismételték., A retinával ellátott szűrőpapírt ezután visszahelyezték a petri-csészébe, majd elmerítették, a szövetet csipesszel eltávolították a szűrőpapírból. Ügyeltek arra, hogy csak a retina szélsőséges kerületét érintsék meg, hogy megőrizzék a retina szerkezeti integritását. A peeling folyamat megkönnyítése érdekében a retina széleit mindkét oldalról óvatosan lehúzzák a szűrőpapírtól, lazítva a retina tapadását a szűrőpapírhoz., Miután a retinát kivették a szűrőpapírból, a szűrőpapír alsó felületét papírtörlőre lyukasztották, majd egy +ROS feliratú csőbe helyezték, és jégen tartották. A fent leírt peeling folyamatot körülbelül 7-8 alkalommal ismételtük meg. 5 hámlás után a retina vékonyabbá, átlátszóbbá vált, hajlamos volt elszakadni. Hámozás után az összegyűjtött szűrőpapírokat tartalmazó + ROS csövet, a maradék hámozott felezett retinát pedig a-ROS csőbe helyeztük, szárazjégen fagyasztva, -80 °C-on tárolva.,
a fotoreceptor rekeszek elválasztása a liofilizált retina hámozásával
ezt a módszert a M. E. Guido, et al. , aki egy ScotchTM tape peeling módszert dolgozott ki, amely liofilizált Csaj retinákat használt a retina szelektív elválasztására különböző rétegekbe (fotoreceptor sejtek, belső nukleáris réteg, ganglion sejtek)., Mivel a retina különböző állati modellekben más-más rúd, toboz, disztribúció, de lehet, hogy külön aszimmetrikusan szalag után lyophilization, mi igazítani ezt a módszert, s feltárása a segédprogram a távolságot rod rekeszek egeret a retinája.
izolált retinaszárítás
Retinaszárítás a “Retinadisszekció” részben leírtak szerint történt. A boncolás során hideg csengőt (130 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 2,4 mM MgCl2, 1,2 mM CaCl2, 10 mM HEPES, 0,02 mM EDTA, pH 7,4) használtunk. Más élettani pufferek, például Ames’-HEPES is használhatók., Mivel több mintát gyakran egyszerre kezeltek, az 5 × 2,5 mm-es szűrőpapír darabokat (Whatman® Grade 1 minőségi szűrőpapír (átmérő 9 cm, pórusméret 11 µm, GE Healthcare, USA) idő előtt címkézték, mielőtt egy hideg csengő pufferrel töltött petri edénybe helyezték őket. Minden egyes minta esetében a szűrőpapírra egy felére csökkent, téglalap alakú retina darabot helyeztek el egy 1,7 mL-es átviteli pipettával (vágott csúcs), a ganglion sejt oldalával lefelé, a fotoreceptor külső szegmensével felfelé., Miután a szövetet a szűrőpapírra összpontosították, mindkettőt kiemelték a csengő pufferéből, és a szűrőpapír alját (a retina nélküli oldalt) papírtörlőre (2-3 tampon) blottálták, hogy megkönnyítsék a ganglion sejtréteg rögzítését a szűrőpapírra. Egy csepp hideg csengő került a retinára,a szűrőpapír alját pedig ismét a papírtörölközőre helyezték. Ezt összesen háromszor megismételték. Ringer puffer cserélték ki az új hideg csengő puffer után minden minta előkészítése., A mellékelt retina szűrőpapírt egy hideg csengővel töltött petri-edénybe helyezték, amíg az összes mintát ugyanolyan módon nem dolgozták fel. Végül mindegyiket ismét kiemelték az oldatból, a szűrőpapír alja megszáradt, és egy csepp hideg PBS-t helyeztek a retina melletti szűrőpapírra, a szűrő alja ismét foltos lett, majd egy tiszta és száraz, 35 × 10 mm-es petri edénybe helyezték. Ennek a lépésnek az volt a célja, hogy a bonyolultabb Ringer-ket PBS-vel öblítsük le, hogy csökkentsük a szárított só mennyiségét a liofilizált szöveten., Miután az összes szövet mintát dolgoztak fel ezzel az utolsó öblítéshez lépés gyűjtött be a tiszta petri-csészében, az étel volt csomagolva a fény a két réteg 2,5 × 2,5 hüvelykes tér darab alufólia, a kis lyukat, úgy, hogy a sötét-adaptált retina mintákat nem ér fény, gyorsan fagyott folyékony N2. A kis lyukak engedélyezett folyékony N2-hozzáférés a belső tér, töltés, a petri-csészébe, majd gondot annak érdekében, hogy a lyukak voltak ellensúlyozni úgy, hogy a petri-csészében volt csomagolva a fény., A petri-csészét ezután egy 600 mL-es Labconco-lombikba helyezték egy VirTis Benchtop 2 K Liofilizátorral (SP Scientific, USA) 30 percig a szövet liofilizálásához.
A retina rétegek ScotchTM szalaggal történő peelingjét
a fagyasztva szárított retina szöveteket -80 °C-on tárolták egy Szárazabbitetm-ben (W. A. Hammond Drierite Co, USA) töltött tartályban, vagy +ROS, +RIS és-ris-kimerült szövetként (- OIS) izolálták, ugyanazon a napon újra fagyasztva vagy feldolgozva nyugati foltokra. Minden peeling eljárást szoba fény alatt végeztünk. Csík kisebb, mint 2.,5 mm szélességet vágtunk, majd a szalagadagoló szélére helyeztük, amíg téglalap alakú darabokra nem vágtuk. A Whatman® szűrőpapírhoz rögzített liofilizált retinát egy tiszta, 10 cm-es petri edénybe helyeztük. Egy kis téglalap alakú ScotchTM szalagot (kissé nagyobb, mint a szövet felülete) vágtak le, majd óvatosan a liofilizált retina tetejére fektették. A szalagot a liofilizált retina tetejére helyezve szinte elegendő volt ahhoz, hogy a narancssárga színű ROS réteget a szalaghoz rögzítse., Annak érdekében, hogy a ROS teljes mértékben érintkezzen a szalaggal, csipesszel enyhe nyomást gyakoroltak a szalag tetejére, hogy biztosítsák a felső felülettel való érintkezést. Miután a szalagot óvatosan eltávolítottuk, a narancssárga színű ROS réteget ragasztottuk a szalaghoz, majd elválasztottuk a retina többi részétől. Ezt a frakciót +ROS címkével látták el, majd egy tiszta mikroszűrő csőbe helyezték. Gyakran vékony, fehér film volt látható a narancssárga réteg törött felületén az első szalaghéjon., Ezt a felületet több szalaghámozással távolították el, amíg teljesen el nem távolították, a Ros réteg narancssárga színét pedig felszínre hozták. Ezt a fehér réteget, amelyet eredetileg a ROS-hoz csatoltak, külön csőbe helyeztük, +RIS frakcióval. Ragasztószalaggal eltávolították a maradék retinális szövetet a szűrőpapírból, majd egy-OIS feliratú csőbe helyezték., A narancssárga színű ROS réteg kezdeti héjához a szalagra alkalmazott nyomás mennyisége befolyásolta a liofilizált minta frakcionálásának módját; túl nagy nyomás miatt az egész liofilizált retina lehámozta a szűrőpapírt a szalagra, és túl kevés nyomás nem választotta el a felső narancssárga réteget a retinától. Egy pár halad át a szalagot a minimális nyomás csipesszel hasznos volt érzés ki a minimális, maximális nyomás, hogy adjunk, hogy a tetején a szalag.,
minta előkészítés Western blot: peeling szűrőpapírral
a + ROS csöveket tartalmazó szűrőpapírokat vetettük alá egy gyors spin egy mikrocentrifuga 2 s és a felesleges folyadékot eltávolítjuk. Mindegyik csövet egyenként dolgozták fel (egy felére csökkent retina), vagy két csövet (két felére csökkent retinát) kombináltak a koncentráltabb anyag érdekében. A + ROS izolátumot egyetlen csőben 45-60 µL hideg RIPA puffer pufferben homogenizáltuk (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% nátrium-deoxikolát, 0,1% SDS, 1 mM EDTA, 0.,1 M PMSF, teljes mini proteáz inhibitor (Roche Applied Sciences), és a-ROS izolátumot egyetlen csőben homogenizáltuk 80-100 µL RIPA pufferben. Két cső kombinálásakor 80-110 µL hideg RIPA puffert használtunk +ROS homogenizálására, és 100-150 µL hideg puffert használtunk-ROS-ra. Az összes csövet 1 percig homogenizáltuk autoklávozott mozsárral. Nagy gondot fordítottak arra, hogy a +ROS csövekben lévő szűrőpapír-darabokat a csövek oldalán tartsák, és ne az alján ragadjanak, hanem a mozsárral érintkezzenek., A homogenizálás után steril csipeszeket használtunk a szűrőpapírdarabok mozgatására a +ROS cső oldalára, majd 2-4 s centrifugálás a mikrocentrifugában. Ez a spin kivonta a folyadékot a papírból, és a folyadékot egy tiszta csőbe helyezték át, majd az alábbiakban leírtak szerint Western blot-ra dolgozták fel. Ez volt a leginkább időigényes lépés, és ha nem megfelelően hajtják végre, a minta nagy részét a szűrőpapír darabjai felszívhatják. A minta visszanyerésének maximalizálása érdekében a héjakhoz használt szűrőpapírdarabok méretét le kell vágni, hogy megfeleljen a retinális szövet területének.,
Minta előkészítése: peeling a ScotchTM szalag
Hasonló a szűrő peeling módszer, két cső, minden doboz hámozott réteg az egyik fél retina, voltak együtt, hogy növelje a fehérje koncentráció. +ROS és + RIS mintákat homogenizáltunk 100-115 µL-ben, és-OIS mintákat 125 µL hideg RIPA pufferben. Minden csövet homogenizáltunk 1 percig. Nagy gondot fordítottak annak biztosítására, hogy a +ROS, +RIS és-OIS csövekben lévő szalag érintkezzen a mozsárral, és hogy a szalagot a csövek oldalán tartsák, ahelyett, hogy az alján ragadnának., A homogenizálás után steril csipeszeket használtak a szalagdarabok mozgatására a csövek oldalára. A csöveket a mini centrifugában 2-4 másodpercig forgatták, majd a szárított szalagdarabokat óvatosan eltávolították.
Fehérje mennyiségi, gél elektroforézis fehérje immunoblots
A BCA protein assay kit (Thermo Scientific, USA) arra használták, hogy meghatározzák a teljes mennyiségű fehérje minden egyes minta. A mintákhoz két mikroliter DNaseI-t (10 egység/µL, Roche, Svájc) adtak, amelyeket szobahőmérsékleten 30 percig hagytak., Megfelelő mennyiségű 4x SDS mintapuffert (40% glicerin, 240 mM Tris bázis pH 6,8, 8% SDS, 5% ßME, 0,04% Bromofenol kék) adtunk a homogenátumhoz.,tr>
Approximately 10 μg of protein lysate was loaded per lane and separated on a pre-cast polyacrylamide Bis-Tris gel with a 4–12% gradient (Life Technologies, USA) and transferred onto nitrocellulose membrane., A membránokat 10% tej/TBS-t pufferben 1 órán át blokkolták RT-nél, és egy éjszakán át inkubálták a következő antitestekkel: nyúl anti-ARR1 antitest (1:1000, ref), egér anti-GNAT1 monoklonális antitest (TF-15, 1:1000, CytoSignal), nyúl anti-β aktin antitest (1:5000, GeneTex Inc.), nyúl anti-RGS9 antitest (1:1000), nyúl anti-Gß5L/S (CT215) (1:2000), valamint nyúl anti-citokróm C poliklonális antitest (1:500, Santa Cruz, sc-7159). A membránokat fluoreszcens címkével ellátott másodlagos antitestekkel (1:10 000, LI-COR Biosciences) inkubáltuk RT-n 1 órán keresztül., A fehérjeszalagokat az Odyssey® infravörös képalkotó rendszer (LI-COR Biosciences, USA) észlelte, az egyes sávok fluoreszcencia intenzitását pedig az ImageJ segítségével számszerűsítették. A GNAT1, ARR1 és RGS9 jelek normalizáltak a gß5l ellen +ROS, +RIS minták, valamint aktin for-ROS és-OIS minták esetén. Minden egyes független kísérlethez az egyes rekeszekben lévő minden egyes fehérje fluoreszkáló jeleit szintén normalizálták az összes retina rekesz kombinált jeleivel szemben. Párosítatlan 2 farkú t-teszteket használtak a két csoport közötti különbségek meghatározására.