bidimensionale Elettroforesi del Gel di Poliacrilammide per Metalloproteina Analisi Basata sul Differenziale Struttura Chimica del Riconoscimento da CBB Colorante

Concetto di metodologia HAC-2D MICS-BN-PAGE / metal detection PAGE., Pannello I: 1D MICROFONI-BN-PAGINA in due corsie. La corsia A è stata sottoposta alla procedura di conversione holo/apo in gel (come nel Pannello II-1), quindi la corsia A è stata sottoposta a 2D MICS-BN-PAGE dopo la conversione holo/apo (come nel Pannello III). La corsia B è stata sottoposta alla pagina di rilevamento Cu2+ e Fe3+ (come nel Pannello II-2). L’elettroferogramma 2D è per una miscela di metalloproteine (holo-Tf, apo-Tf, holo-Cp e holo-SOD), in cui le holo-metalloproteine nel campione originale sono state isolate come macchie dalla linea diagonale (la linea gialla tratteggiata nel pannello III). Versioni full-size di elettroferogrammi rappresentati in Fig., 2 sono raffigurati in Fig. S2.

Per superare questa limitazione, le informazioni fornite dall’analisi della pagina MICS-BN-PAGE / metal detection 1D della corsia B vengono aumentate sottoponendo la corsia A a una seconda dimensione di MICS-BN-PAGE dopo la conversione holo / apo. Per effettuare questa analisi, la corsia A viene prima immersa in una soluzione chelante metallica acida (vedere la sezione Metodi e supplementari per le condizioni dettagliate) per la conversione holo/apo (Fig. 2 pannello II-1)., In tal modo, le holo-metalloproteine vengono derivatizzate in apo-metalloproteine prive di metalli nel gel della prima dimensione della PAGINA. La corsia A trattata viene quindi consegnata al secondo stadio MICS-BN-PAGE con l’ausilio di un gel di agarosio privo di metalli (vedere Informazioni supplementari). Nella seconda fase MICS-BN-PAGE (Fig. 2, panel III), le apo-metalloproteine e le non metalloproteine del campione originale migrano sulla linea diagonale, poiché la migrazione di queste specie nella seconda dimensione della PAGINA è completamente identica alla loro migrazione nella prima dimensione della PAGINA., D’altra parte, le holo-metalloproteine del campione originale migrano distanze diverse nella prima e nella seconda dimensione MICS-BN-PAGE, poiché queste proteine migrano come le loro forme holo nella prima dimensione e come le loro forme apo nella seconda dimensione (e poiché MICS-BN-PAGE produce una diversa mobilità elettroforetica per le forme holo-e apo delle metalloproteine; vide infra). Pertanto, solo le holo-metalloproteine del campione originale migrano dalla linea diagonale nella seconda dimensione, per essere identificate da MALDI-TOF MS senza alcuna ulteriore purificazione proteica., I tipi e le quantità di ioni metallici legati con metalloproteine nella soluzione campione originale (quelli isolati come punti fuori diagonale), possono essere determinati dalla PAGINA di rilevamento dei metalli della corsia B, come descritto sopra. Quindi, le informazioni relative all’identificazione e alla distribuzione delle specie di metalloproteina, insieme alle identità e alle concentrazioni di ioni metallici che legano, sono accessibili da questa nuova metodologia HAC-2D MICS-BN-PAGE/metal detection PAGE.,

Isolamento selettivo delle metalloproteine in HAC-2D MICS-BN-PAGE

Per proof-of-concept, HAC-2D MICS-BN-PAGE/metal detection PAGE è stato dimostrato per una miscela campione contenente gli standard di proteine holo-Tf, apo-Tf, holo-Cp e holo-SOD (con conseguente elettroferogramma 2D in Fig. 2, pannello III), e anche per un campione di siero umano (Fig. S3). Macchie di holo-metalloproteine che migravano fuori dalla linea diagonale sono state osservate con successo per il campione di proteine miste., Inoltre, Fe3 + è stato rilevato nella posizione di holo-Tf e Cu2 + nelle posizioni di holo-Cp e holo-SOD, nella prima fase di MICS-BN-PAGE utilizzando metal detection PAGE. Se non viene eseguita alcuna conversione holo/apo, tutte le proteine migrano sulla linea diagonale (Fig. S5). Per un campione di siero umano, holo-Tf e holo-Cp sono stati rilevati con successo (Fig. S3)., Pertanto, si è concluso che HAC-2D MICS-BN-PAGE/metal detection PAGE è molto efficace per l’isolamento delle holo-metalloproteine e l’identificazione di ioni metallici originariamente legati alle metalloproteine in una miscela proteica.

Infine, il metodo HAC-2D MICS-BN-PAGE è stato applicato a una frazione proteica solubile batterica totale ottenuta da cellule di R. gelatinosus coltivate in presenza di 1,2 mM Cu2+, esprimendo la proteina CopI. Questo rappresenta un campione di proteine biologiche., Per questo esempio, è stato trovato un punto fuori dalla linea diagonale nella posizione di 100 kDa e 29 kDa nella prima e nella seconda PAGINA, rispettivamente (Fig. 3 bis). Un’alta concentrazione di Cu2 + è stata osservata nella posizione di 97-139 kDa nella prima PAGINA MICS-BN (Fig. 3 ter). Di conseguenza, si è concluso che la proteina in questo punto ha Cu ion legato ad esso. Lo spot è stato tagliato e successivamente analizzato da MALDI-TOF MS. Sono stati identificati peptidi corrispondenti a CopI (Fig. 3c, Fig. supplementare S7 e Tabella S1)., Inoltre, quando questo spot gel è stato eseguito su SDS-PAGE, è stata osservata una singola banda di proteine CopI (dati non mostrati). Un altro punto della linea diagonale è stato osservato a circa 40 kDa (sopra il punto CopI di 29 kDa nella seconda dimensione (Fig. 3 bis)). È stato confermato da MALDI-TOF MS che questo punto proveniva anche da CopI (ed era probabilmente un dimero di CopI in base al peso molecolare). Pertanto, una metalloproteina potrebbe essere specificamente isolata da una miscela proteica complessa identificando anche il suo metallo legato., Questa analisi di HAC-2D MICS-BN-PAGE ha sicuramente dimostrato che CopI è una proteina legante il rame e, curiosamente, che questa proprietà potrebbe essere correlata alla funzione di disintossicazione della proteina nel periplasma batterico. Ulteriori analisi quantitative hanno rivelato la stechiometria dello C Cu a CopI come 1: 1 (basata sulle concentrazioni dello bound Cu legato (1,05 µM) e della proteina holo-CopI (0,95 µM) come determinato dalla colorazione CBB R-250). Questo è in totale accordo con altri risultati sperimentali, che hanno trovato una stechiometria Cu:CopI di 1:1.2 usando ICP-MS con CopI puro (Durand et al.,, dati non pubblicati). Questo risultato suggerisce che il nostro metodo è utile anche per le indagini sulle stechiometrie metalloproteiche.

HAC-2D MICROFONI-BN-PAGE impiegando la colorazione silver (a), con Cu2+ PAGINA di rilevamento (b), di una frazione solubile ottenuto da R. gelatinosus cellule coltivate in presenza di 1.2 mM Cu2+ (proteine totali: 31.5 µg). Il punto fuori diagonale indicato dall’asterisco di cui alla lettera a) è stato sottoposto a MS MALDI-TOF (Fig., S7), identificando le sequenze mostrate in caratteri rossi come parte della sequenza CopI matura (c). Versioni full-size di elettroferogrammi rappresentati in Fig. 3 sono raffigurati in Fig.supplementare. S8.

Esperimenti di elettroforesi capillare per studiare le modalità di riconoscimento molecolare

Il miglioramento della risoluzione tra forme holo-e apo-in MICS-PAGE assistito con colorante CBB (Fig., 1c-e) è una chiave importante per la nostra metodologia e, curiosamente, questo riconoscimento molecolare sembra provenire da diversi numeri di molecole di colorante CBB G-250 che si legano a ciascuna delle forme holo – vs. apo delle metalloproteine. Questo, a sua volta, probabilmente si traduce in diverse cariche efficaci e/o strutture steriche indotte, per i complessi di proteine coloranti. Entrambi questi effetti avrebbero un impatto sulla mobilità elettroforetica., Per ottenere informazioni più approfondite sul meccanismo di riconoscimento del legame del colorante CBB G-250 verso holo – e apo-Tf, sono stati condotti esperimenti CE, insieme a simulazioni di docking utilizzando il programma AutoDock Vina 24,25 (vide infra). CZE è condotto in soluzione acquosa libera senza una matrice di gel, e quindi un effetto setacciatura molecolare non deve essere considerato nelle simulazioni. La mobilità elettroforetica di holo-Tf misurata da CZE era ovviamente diversa da quella di apo-Tf con l’aggiunta del colorante CBB (Fig. 4), mentre queste proteine avevano mobilità identiche in assenza del colorante., Questo fatto suggerisce fortemente che il numero di molecole di colorante legate con holo – e apo-metalloproteine è diverso. In CZE, la migrazione del complesso proteina-colorante sarebbe prevalentemente influenzata dalla carica efficace del complesso, che, a sua volta, sarebbe influenzata dal numero di molecole di colorante anionico CBB a carica singola legate alla proteina.,

Tipico elettroferogrammi da CZE esperimenti per: 10 µM holo – o apo-Tf senza CBB G 250 (superiore traccia verde); e i miscugli contenenti, 5 mM CBB G-250 colorante con 10 µM holo-Tf (medio traccia blu) o con 10 µM apo-Tf (inferiore traccia rossa).,

Tradizionalmente, la mobilità elettroforetica di proteine in soluzione è rappresentata da Henry equazione, come mostrato nell’equazione (1):

Ecco, Q, h, R e k rappresentano la carica netta, la soluzione viscosità, il raggio della proteina, e l’inversa della lunghezza di Debye della soluzione elettrolitica. La funzione di Henry, H, aumenta monotonicamente da 2/3 a 1., A rigor di termini, questa formula si applica esclusivamente a una molecola sferica con una distribuzione di carica centrosimmetrica, anche se ci sono alcune discussioni per modificare l’equazione di Henry da applicare a proteine non sferiche con distribuzione di carica complessa (inclusi dipolo e quadrupolo)26. Nel nostro caso, le molecole holo – e apo-Tf sono sfere deformate di dimensioni molto simili (simili a sferoidi con lunghezze degli assi lunghe e corte di circa 92 e 60 Å (holo-Tf) e 93 e 68 Å (apo-Tf), rispettivamente) (Fig. S9)., Inoltre, il dipolo e il quadrupolo dovrebbero avere solo un effetto minore sulla mobilità poiché le molecole CBB G-250 legate a holo-/apo-Tf non sono localizzate, come mostrato nella Fig supplementare. S9 (vedi sotto). I risultati di calcoli precisi di Kim et al.26 mostrano che la mobilità elettroforetica di una proteina sferoidale non è significativamente influenzata da un quadrupolo in soluzioni di bassa forza ionica (I< 0.01 M), e la forza ionica del buffer di separazione nei nostri esperimenti CZE era altrettanto bassa (I = 0.013 M).,

Quindi, il rapporto tra mobilità elettroforetica di apo – e holo-Tf complessato con colorante CBB G-250 (vale a dire, µApo/µHolo), è attribuito al rapporto tra le cariche nette di ciascun complesso (vale a dire, QApo / QHolo), che può essere facilmente derivato dall’equazione di Henry. Le cariche nette negative dei complessi Tf-CBB G-250 provengono principalmente dal numero di legame del colorante. Di conseguenza, il valore di µApo / µHolo fornisce anche il rapporto tra i numeri di colorante (vale a dire, NApo/NHolo). Sperimentalmente, il rapporto tra mobilità elettroforetica delle due forme di Tf (µApo / µHolo = (-2.69 × 10-4)/(-2.,09 × 10-4)) è stato trovato per essere 1.29 da CZE (Fig. 4), che corrisponde al rapporto di carica elettrica effettiva, a condizione che le dimensioni di entrambe le forme di Tf siano simili. Quindi, il rapporto tra mobilità elettroforetica dovrebbe essere d’accordo con il rapporto tra le molecole di colorante legate. Tuttavia, un’ulteriore discussione sulla relazione tra mobilità elettroforetica e forma proteica per altre metalloproteine è necessaria nei casi in cui le forme holo-e apo-proteiche differiscono (come per Cp).,

Simulazione di docking molecolare esperimenti per studiare le modalità di riconoscimento molecolare

Il legame con il colorante è stato determinato da simulazioni di docking molecolare flessibile di AutoDock Vina27, progettate per cercare in modo esaustivo i siti di legame e per calcolare le loro energie libere (Fig. 5 e ulteriori Fig. S9). Recentemente, Wang et al.25 ha riferito che AutoDock Vina ha una potenza di punteggio elevata e una potenza di campionamento intermedia rispetto ad altri programmi di docking ampiamente utilizzati., Secondo queste simulazioni, un numero maggiore di molecole di colorante CBB G-250 legate a siti di legame Fe vacanti in apo-Tf rispetto a holo-Tf (Fig. 5a) sono stati osservati. Sulla base di queste simulazioni Autodock Vina, il rapporto tra il numero di legame del colorante NApo/NHolo è risultato essere 1,23, con un’energia di legame <-6,5 kcal / mol (corrispondente a K ~ 104,4 M-1) (Fig. 5b per la distribuzione della frequenza cumulativa del numero di legame del colorante in funzione dell’energia di legame), che è in buon accordo con i nostri risultati CZE, discussi in precedenza (NApo/NHolo = 1.29)., Il legame quantitativo si presume con l’aggiunta del colorante a livelli di mM (oltre il 95% dei siti di legame interagiscono con il colorante quando log K è 4,4 o più grande), come in questi esperimenti.

Il numero di legame di molecole di colorante con holo-Tf è stato anche studiato da esperimenti CZE (dati non mostrati), come giudicato dalla diminuzione del picco di colorante libero per un campione di colorante CBB G-250 da 1 mm con e senza l’aggiunta di holo-Tf da 10 µM., Poiché il numero di legame è stato misurato per essere >18, il numero di legame di NHolo è stato presunto essere > 20 negli esperimenti MICS-BN-PAGE (con colorante 3.0 mM aggiunto). Questo numero vincolante di molecole di colorante (>20) dagli esperimenti CZE è in buon accordo con il numero di molecole di colorante legato (N = 21) dalle simulazioni di docking molecolare che darebbero origine all’affinità prevista di -6.5 kcal/mol, e quindi i nostri risultati sono auto-coerenti.,

Si è visto da queste simulazioni di docking molecolare e esperimenti CZE che CBB G-250 dye riconosce le diverse strutture chimiche di holo – e apo-metalloproteine per produrre diversi valori µ. Osservazioni più dettagliate delle modalità di legame simulate suggeriscono anche che la molecola CBB G-250 interagisce con i residui di aminoacidi accessibili a causa della struttura apo-Tf più aperta (dispiegata) rispetto alla struttura holo-Tf più chiusa (piegata), mentre il colorante non mostra alcun legame direttamente con i residui di aminoacidi leganti Fe (Asp392, Tyr429, Tyr517 e His 585)., Pertanto, è implicito che il colorante riconosca piccole differenze tra le strutture chimiche piegate e dispiegate delle metalloproteine, che sono indotte dal legame o dalla dissociazione degli ioni metallici. Tali piccole differenze non possono essere identificate con altri metodi di separazione convenzionali.

Residui di amminoacidi che entrano in contatto con la molecola colorante in ciascun sito di legame colorante nella simulazione (ad esempio, Fig. S10) sono stati classificati in base alla loro natura dominante: carica idrofobica, idrofila o elettrostatica (come riassunto nella tabella supplementare S2 e Tabella S3)., Secondo i risultati, le popolazioni di ciascun tipo di amminoacido che interagiscono con le molecole di colorante non hanno mostrato alcuna differenza tra forme holo – e apo-proteiche (26-27% per idrofobo, 37-40% per idrofilo, 33-35% per residui carichi in ogni forma). Tuttavia, il numero di legami idrogeno in apo-Tf (33 totale; 1,2 per sito di legame) era significativamente più grande che in holo-Tf (19 totale; 0,9 per sito di legame). Quando ci si è concentrati sugli otto siti di legame in apo-Tf che non erano presenti in holo-Tf (Tabella supplementare S3), il numero di legami H per sito è risultato essere 2.1., Questi risultati suggeriscono fortemente che i cambiamenti nelle interazioni del legame idrogeno sono i principali responsabili della differenziazione tra forme holo – e apo-Tf, mentre sarebbero necessarie ulteriori indagini per comprendere il meccanismo completo.