Lo sviluppo, la differenziazione e la crescita di cellule e tessuti richiedono modelli di espressione genica regolati con precisione. Gli esaltatori funzionano come elementi cis-regolatori per mediare il controllo spaziale e temporale dello sviluppo attivando la trascrizione in cellule specifiche e/o reprimendola in altre cellule. Pertanto, la particolare combinazione di fattori di trascrizione e altre proteine leganti il DNA in un tessuto in via di sviluppo controlla quali geni saranno espressi in quel tessuto. Gli esaltatori consentono di utilizzare lo stesso gene in diversi processi nello spazio e nel tempo.,
Identificazione e caratterizzazioneedit
Tradizionalmente, gli enhancer sono stati identificati mediante tecniche di trap enhancer utilizzando un gene reporter o mediante analisi di sequenza comparativa e genomica computazionale. In modelli geneticamente trattabili come la mosca della frutta Drosophila melanogaster, ad esempio, un costrutto reporter come il gene lacZ può essere integrato casualmente nel genoma utilizzando un trasposone dell’elemento P. Se il gene reporter si integra vicino a un potenziatore, la sua espressione rifletterà il modello di espressione guidato da quel potenziatore., Pertanto, la colorazione delle mosche per l’espressione o l’attività di LacZ e la clonazione della sequenza che circonda il sito di integrazione consente l’identificazione della sequenza di enhancer.
Lo sviluppo di tecnologie genomiche ed epigenomiche, tuttavia, ha cambiato radicalmente le prospettive per la scoperta di moduli cis-regulatory (CRM)., I metodi di sequenziamento di nuova generazione (NGS) ora consentono saggi di scoperta CRM funzionale ad alto throughput e le quantità enormemente crescenti di dati disponibili, incluse librerie su larga scala di motivi TFBS (Transcription factor-Binding site), raccolte di CRM annotati e convalidati e dati epigenetici estesi su molti tipi di cellule, stanno rendendo la scoperta CRM computazionale accurata un obiettivo raggiungibile. Un esempio di approccio basato su NGS chiamato DNase-seq hanno permesso l’identificazione di nucleosoma impoverito, o regioni cromatina aperte, che possono contenere CRM., Più recentemente sono state sviluppate tecniche come ATAC-seq che richiedono meno materiale di partenza. Le regioni impoverite del nucelosoma possono essere identificate in vivo con espressione della metilasi di Dam, tenendo conto maggior controllo dell’identificazione specifica del enhancer del tipo cellulare.I metodi computazionali includono genomica comparativa, clustering di siti di legame TF noti o previsti e approcci di apprendimento automatico supervisionati addestrati su CRM noti., Tutti questi metodi si sono dimostrati efficaci per la scoperta del CRM, ma ognuno ha le proprie considerazioni e limitazioni e ciascuno è soggetto a un numero maggiore o minore di falsi positivi identifications.In l’approccio genomico comparativo, conservazione della sequenza delle regioni non codificanti può essere indicativo di potenziatori. Le sequenze di più specie sono allineate e le regioni conservate sono identificate computazionalmente., Le sequenze identificate possono quindi essere collegate a un gene reporter come la proteina fluorescente verde o lacZ per determinare il modello in vivo di espressione genica prodotto dal potenziatore quando iniettato in un embrione. L’espressione del mRNA del reporter può essere visualizzata dall’ibridazione in situ, che fornisce una misura più diretta dell’attività del potenziatore, poiché non è soggetta alle complessità della traduzione e del ripiegamento delle proteine., Sebbene molte prove abbiano indicato la conservazione della sequenza per gli stimolatori critici dello sviluppo, altri lavori hanno dimostrato che la funzione degli esaltatori può essere conservata con poca o nessuna conservazione della sequenza primaria. Ad esempio, i potenziatori RET negli esseri umani hanno una conservazione della sequenza molto ridotta rispetto a quelli dello zebrafish, ma le sequenze di entrambe le specie producono modelli quasi identici di espressione genica reporter nello zebrafish., Allo stesso modo, in insetti altamente divergenti (separati da circa 350 milioni di anni), modelli di espressione genica simili di diversi geni chiave sono stati regolati attraverso CRM costituiti in modo simile, sebbene questi CRM non mostrino alcuna conservazione apprezzabile della sequenza rilevabile da metodi standard di allineamento delle sequenze come l’ESPLOSIONE.
Nella segmentazione degli insettimodifica
Gli esaltatori che determinano la segmentazione precoce negli embrioni di Drosophila melanogaster sono tra i migliori esaltatori dello sviluppo caratterizzati., Nel primo embrione di mosca, i fattori di trascrizione del gene gap sono responsabili dell’attivazione e della repressione di un certo numero di geni di segmentazione, come i geni della regola della coppia. I geni gap sono espressi in blocchi lungo l’asse anteriore-posteriore della mosca insieme ad altri fattori di trascrizione dell’effetto materno, creando così zone all’interno delle quali sono espresse diverse combinazioni di fattori di trascrizione. I geni della coppia-regola sono separati l’uno dall’altro dalle cellule non esprimenti. Inoltre, le strisce di espressione per diversi geni a regola di coppia sono compensate da alcuni diametri di cellule l’uno dall’altro., Pertanto, combinazioni uniche di espressione genica a regola di coppia creano domini spaziali lungo l’asse anteriore-posteriore per impostare ciascuno dei 14 singoli segmenti. Il 480 bp enhancer responsabile per la guida della striscia tagliente due della coppia-regola gene even-skipped (eve) è stato ben caratterizzato. Il potenziatore contiene 12 diversi siti di legame per i fattori di trascrizione del gene materno e gap. L’attivazione e la repressione dei siti si sovrappongono in sequenza., Eve è espresso solo in una stretta striscia di cellule che contengono alte concentrazioni degli attivatori e bassa concentrazione dei repressori per questa sequenza di enhancer. Altre regioni di enhancer guidano l’espressione di eve in altre 6 strisce nell’embrione.
Nel modello dei vertebratimodifica
Stabilire gli assi del corpo è un passo fondamentale nello sviluppo animale. Durante lo sviluppo embrionale del topo, Nodale, un fattore di crescita trasformante – beta superfamiglia ligando, è un gene chiave coinvolto nel patterning sia l’asse anteriore-posteriore e l’asse sinistro-destro del primo embrione., Il gene nodale contiene due enhancer: l’Enhancer prossimale dell’epiblasto (PEE) e l’Enhancer asimmetrico (ASE). La PIPÌ è a monte del gene nodale e guida l’espressione nodale nella porzione della striscia primitiva che si differenzierà nel nodo (noto anche come nodo primitivo). La PIPÌ attiva l’espressione nodale in risposta a una combinazione di segnalazione Wnt più un secondo segnale sconosciuto; quindi, un membro della famiglia di fattori di trascrizione LEF/TCF si lega probabilmente a un sito di legame TCF nelle cellule del nodo., La diffusione del nodale lontano dal nodo forma un gradiente che poi modella l’asse anteriore-posteriore estensibile dell’embrione. L’ASE è un potenziatore intronico legato dal fattore di trascrizione Fox1 del dominio della testa della forcella. All’inizio dello sviluppo, l’espressione nodale guidata da Fox1 stabilisce l’endoderma viscerale. Più tardi nello sviluppo, il legame Fox1 con l’ASE spinge l’espressione nodale sul lato sinistro del mesoderma della piastra laterale, stabilendo così l’asimmetria sinistra-destra necessaria per lo sviluppo asimmetrico dell’organo nel mesoderma.,
Stabilire tre strati germinali durante la gastrulazione è un altro passo fondamentale nello sviluppo animale. Ciascuno dei tre strati germinali ha modelli unici di espressione genica che promuovono la loro differenziazione e sviluppo. L’endoderma è specificato all’inizio dello sviluppo dall’espressione Gata4 e Gata4 continua a dirigere la morfogenesi intestinale in seguito. L’espressione di Gata4 è controllata nell’embrione iniziale da un potenziatore intronico che lega un altro fattore di trascrizione del dominio della biforcazione, FoxA2., Inizialmente il potenziatore guida un’ampia espressione genica in tutto l’embrione, ma l’espressione si limita rapidamente all’endoderma, suggerendo che altri repressori possono essere coinvolti nella sua restrizione. In ritardo nello sviluppo, lo stesso enhancer limita l’espressione ai tessuti che diventeranno lo stomaco e il pancreas. Un potenziatore aggiuntivo è responsabile del mantenimento dell’espressione di Gata4 nell’endoderma durante le fasi intermedie dello sviluppo intestinale.,
I potenziatori multipli promuovono la robustezza dello sviluppomodifica
Alcuni geni coinvolti nei processi di sviluppo critici contengono più potenziatori della funzione di sovrapposizione. Gli enhancer secondari, o “enhancer dell’ombra”, possono essere trovati molti kilobases a partire dall’enhancer primario (“primario” si riferisce solitamente al primo enhancer scoperto, che è spesso più vicino al gene che regola). Da solo, ogni enhancer guida modelli quasi identici di espressione genica. I due esaltatori sono veramente ridondanti?, Lavori recenti hanno dimostrato che più esaltatori consentono ai moscerini della frutta di sopravvivere alle perturbazioni ambientali, come un aumento della temperatura. Una volta sollevato ad una temperatura elevata, un singolo enhancer a volte non riesce a guidare il modello completo di espressione, mentre la presenza di entrambi i enhancer permette l’espressione genica normale.