La tecnica di base per il rilevamento di RFLPs prevede la frammentazione di un campione di DNA con l’applicazione di un enzima di restrizione, che può fendere selettivamente una molecola di DNA ovunque venga riconosciuta una breve sequenza specifica in un processo noto come digest di restrizione. I frammenti di DNA prodotti dal digest vengono quindi separati per lunghezza attraverso un processo noto come elettroforesi su gel di agarosio e trasferiti a una membrana tramite la procedura Southern blot., L’ibridazione della membrana ad una sonda etichettata del DNA poi determina la lunghezza dei frammenti che sono complementari alla sonda. Si dice che un polimorfismo di lunghezza del frammento di restrizione si verifichi quando la lunghezza di un frammento rilevato varia tra gli individui, indicando omologie di sequenza non identiche. Ogni lunghezza frammento è considerato un allele, se in realtà contiene una regione di codifica o no, e può essere utilizzato in successive analisi genetiche.,
Schematica per RFLP dal sito di clivaggio perdita
Analisi e l’eredità di allelica RFLP frammenti (NIH)
Schematica per RFLP da VNTR la variazione di lunghezza
ExamplesEdit
Ci sono due meccanismi che la dimensione di un particolare restrizione frammento può variare. Nel primo schema, un piccolo segmento del genoma viene rilevato da una sonda di DNA (linea più spessa)., Nell’allele A, il genoma viene scisso da un enzima di restrizione in tre siti vicini (triangoli), ma solo il frammento più a destra verrà rilevato dalla sonda. Nell’allele a, il sito di restrizione 2 è stato perso da una mutazione, quindi la sonda ora rileva il frammento fuso più grande che va dai siti 1 a 3. Il secondo diagramma mostra come questa variazione della dimensione del frammento apparirebbe su una macchia meridionale e come ogni allele (due per individuo) potrebbe essere ereditato nei membri di una famiglia.,
Nel terzo schema, la sonda e l’enzima di restrizione vengono scelti per rilevare una regione del genoma che include un segmento di ripetizione tandem a numero variabile (VNTR) (scatole nel diagramma schematico). Nell’allele c, ci sono cinque ripetizioni nel VNTR e la sonda rileva un frammento più lungo tra i due siti di restrizione. Nell’allele d, ci sono solo due ripetizioni nel VNTR, quindi la sonda rileva un frammento più breve tra gli stessi due siti di restrizione. Altri processi genetici, come inserimenti, delezioni, traslocazioni e inversioni, possono anche portare a polimorfismi., I test RFLP richiedono campioni di DNA molto più grandi rispetto ai test a ripetizione in tandem (STR).