Effetti di agenti mutageni sulla sequenza di DNA nelle piante
Sfondo:
impianto Moderno, gli allevatori e gli agricoltori possono sfruttare una ricchezza di biodiversità naturale, che può essere ampiamente allargato attraverso theapplication di mutazione tecniche di induzione., L’impatto della mutazione indotta sul miglioramento delle colture si riflette nelle 2316 varietà ufficialmente registrate (database dell’AIEA sulle varietà mutanti ufficialmente registrate, MVD) che presentano una nuova variazione indotta. Inoltre, circa tre quarti di queste sono varietà mutanti dirette derivate dal trattamento con raggi gamma, evidenziando così l’importanza dei mutageni fisici. Tutto ciò si traduce in un enorme impatto economico sull’agricoltura e la produzione alimentare che è attualmente valutata in miliardi di dollarie milioni di ettari coltivati (Ahloowalia et al. in preparazione.)., Tuttavia, mentre il potenziale agronomico della mutazione indotta è ben compreso, gli effetti precisi di diversi agenti mutageni sulla sequenza del DNA nelle piante non sono mai stati descritti. Inoltre, negli ultimi anni nuove tecnologie di genetica inversa e di scoperta genica hanno stimolato un rinnovato interesse per la mutazione indotta. Per queste nuove applicazioni è necessario comprendere più chiaramente i tipi di mutazioni generate dalle diverse classi di mutageni e misurare la loro frequenza e distribuzione lungo il genoma., Oggi, e per la prima volta, le tecnologie sono in atto per intraprendere gli esperimenti necessari per ottenere questa comprensione.
Gli agenti mutageni possono essere classificati in tre categorie: fisici (ad esempio, raggi gamma), chimici (ad esempio,etilmetan solfonato) ed elementi trasponibili (come trasposoni, retrotrasposoni, T-DNA, retrovirus). Attualmente sono disponibili dati limitati sulla portata degli effetti genetici indotti a livello molecolare nelle piante e sulla specificità e sull’efficienza relativa di queste diverse categorie di agenti., Questi effetti comportano danni al DNA, che si traduce in cambiamenti di coppia di basi (polimorfismi nucleotidici singoli/semplici, SNPS),piccoli inserimenti e delezioni (indel) e riarrangiamenti cromosomici. Ancora meno è noto su come la mutazione indotta interagisca con i processi epigenetici,come la metilazione, l’attivazione di retro-elementi e la perturbazione della struttura del DNA di ordine superiore.,
Mentre gli allevatori hanno utilizzato l’induzione di mutazioni per ampliare la base genetica del germoplasma e hanno utilizzato le linee mutanti direttamente come nuove varietà o come fonti di nuova variazionein programmi di cross-breeding, la conoscenza della natura precisa delle mutazioni indotte non era necessaria. Intuitivamente un livello conservativo di piccola coppia di base riarrangiamento e cancellazione è stato considerato ideale. Oggigiorno, l’uso di tecniche di mutazione si è esteso oltre le applicazioni nell’allevamento alla scoperta genica e alla genetica inversa., Le nuove applicazioni di alto-capacità di lavorazione richiedono le classi specifiche di mutazioni che sono indotte con alta efficienza sopra i genomi interi della pianta del raccolto e di conseguenza knowledgeof la natura precisa della mutazione indotta sta diventando un problema.
I metodi di scoperta genica ad alto throughput dipendono fortemente dalle linee “knockout” inserzionali, dalle ormai classiche “macchine geniche” e dalle librerie “knockout” di eliminazione. La mutagenesi inserzionale comporta l’induzione di una maggiore attività di trasposizione di elementi trasponibili noti (ad es., retrotrasposoni che tendono a trasporre in geni attivi) per produrre serie di linesin che, in teoria, ogni gene nel genoma sarà stato inattivato dall’inserimento del trasposone. Queste linee possono essere utilizzate per identificare i geni che causano particolari fenotipi o, al contrario, possono essere utilizzate per identificare la funzione genica cercando un fenotipo associato all’inattivazione di un particolare gene noto. Tuttavia, i mutanti inserzionali hanno atendency di essere instabili (cioè l’escissione del tag trasposone, ad esempio, Sistema binario Ac / Ds, nella prossima generazione potrebbe causare il ritorno del fenotipo al tipo genitore originale, o l’attivazione di tag retrotrasposoni attraverso diversi stress potrebbe moltiplicare gli eventi di inserimento, ad esempio durante la micropropagazione). Rispetto alla mutagenesi inserzionale, l’induzione convenzionalemutazione (cioè utilizzando agenti fisici o chimici) fornisce il vantaggio di mutazioni stabili.
In teoria, la produzione di librerie di cancellazione comporta l’induzione di eliminazioni moderatamente grandi, idealmente da 1 kb a 100 kb di dimensione, in ciascuna di una serie di linee.,Queste eliminazioni dovrebbero comprendere segmenti di ogni gene nel repertorio genetico e dovrebbero essere rappresentati almeno da una riga nella libreria di delezione. Queste linee di delezione possono, una volta usate insieme alle matrici intere del gene del genoma, essere usate per identificare i geni responsabili di fenotipi particolari o per confermare l’associazione dei geni conosciuti con i fenotipi particolari.
Un nuovo e importante approccio di genetica inversa è ‘targeting lesioni locali indotte nei genomi’ (LAVORAZIONE)., Qui, un gran numero di piccoli cambiamenti, sostituzioni di coppie di basi del DNA o piccole delezioni che coprono non più di poche coppie di basi, sono indotte in una serie di linee. In queste linee la funzione genica può essere accertata associando un fenotipo con i cambiamenti in un particolare gene e possono essere generati nuovi alleli di geni noti.
Nei prossimi anni, nuove tecnologie come queste avranno un impatto crescente nell’allevamento pratico delle piante. Tuttavia, richiederanno diversi tipi di mutazioni indotte a specifiche frequenze., Al fine di adattare il processo di mutazione, ci sarà la necessità di capire come specifiche classi di mutazioni sono generati e distribuiti su genomi. In passato, ciò non è stato possibile a causa della mancanza di strumenti analitici e di una conoscenza inadeguata sia del processo di danno al DNA che dell’architettura dei genomi vegetali. Inoltre, solo un limitatonumero di geni vegetali sono stati sequenziati. Oggi, metodi di sequenziamento del DNA ad alto rendimento accoppiati con bioinformatica e approcci genomici funzionali forniscono un’ampia architettura del genoma knowledgeon., La sequenza completa di DNA genomico di una pianta dicotiledone modello, Arabidopsis, e un monocotiledone modello, riso è diventato disponibile di recente. Anche gli scienziati si trovano ora con una serie di metodi, per lo più sviluppati come tecnologie di marcatori molecolari che possono essere adattati per quantificare i cambiamenti nella sequenza del DNA. Tutto sommato, thestage è impostato per trasferire la scienza del danno al DNA indotto da mutageni fisici e chimici dalla genetica umana ai sistemi vegetali., Una gamma di tecnologie può ora essere utilizzata per quantificare il tasso di base sottostante, su un numero di generazioni, di mutazione spontanea e gli effetti istantanei degli agenti di mutazione. Così gli scienziati ora finalmente si trovano in una posizione per intraprendere esperimenti che possono svelare i tipi di mutazioni indotte da diversi mutageni in modo che i futuri utenti di mutazione indotta possono utilizzare la tecnologia in un informedmanner completamente.,
Obiettivi:
L’obiettivo è quello di comprendere il meccanismo di mutazione induzione in piante e quantificare i tipi (base pairchanges o delezioni), le frequenze (tassi di variazione relativa a mutageni dose) e modelli (induzione di cambiamenti in diverse parti del genoma) di modifiche in DNAinduced da una serie di fisici e chimici mutageni in una serie di importanti specie di piante coltivate. Marker molecolare, matrice di DNA e nuove metodologie genetiche inverse saranno utilizzate in un approccio unico per analizzare e studiare l’induzione di mutazioni suscitate in un certo numero di piante di importanza agronomica., Questi risultati saranno utilizzati per fornire protocolli e linee guida importanti per l’uso futuro della mutazione indotta nella biologia delle piante e nel miglioramento delle colture. Le conoscenze acquisite aiuteranno gli Stati membri a migliorare i programmi di allevamento delle colture mediante l’applicazione di mutazioni indotte mirate e di approcci genomici complementari con l’obiettivo di aumentare la sostenibilità agricola, la sicurezza alimentare e la stabilità economica. Questo CRP sfrutterà nuovi sviluppi nell’analisi del DNA e nella genomica per definire tipi, frequenze, tassi e modelli di mutazione indotti dai diversi mutageni., Ciò genererà una base di conoscenza che guiderà e assisterà i futuri utenti delle tecnologie indotte della mutazione per il miglioramento e la genomica del raccolto.Inoltre, si concentrerà sui mutageni fisici, come la gamma e la radiazione di neutroni veloci o raggi X. I mutageni chimici selezionati saranno utilizzati anche per confrontare l’efficienza relativa di entrambi i tipi di agenti mutageni. Gli effetti di questi mutageni saranno valutati su sementi geneticamente omogenee e materiale vegetale propagato vegetativamente.,Gli obiettivi principali specifici includono:
- Determinazione dei meccanismi e dei livelli totali di danno al DNA alla generazione M1, ad esempio direttamente nei semi trattati nei test pre e post – germinazione.
- Determinare tipi, frequenze, tassi e modelli di mutazioni nelle generazioni M2, su (a) genomi interi e (b) in sequenze di DNA mirate all’interno dei genomi.
- Determinare il tipo e il tasso di mutazione spontanea nel corso delle generazioni in gruppi vegetali chiave (ad esempio, un sistema vegetale selezionato, per determinare il tasso spontaneo come base e come indicatore intrinseco della mutagenicità del genotipo).,
- Preparazione di protocolli e linee guida per l’uso di particolari mutageni per una serie di applicazioni specifiche nel miglioramento delle colture e nella genomica.
- Determinare le basi chimiche e molecolari per la sensibilità differenziale alle radiazioni in diverse varietà della stessa specie di colture.
- Quantificare il tipo e il tasso di mutazione spontanea basale, utilizzando esperimenti di accumulo di mutazioni multi-generazione.
Partecipanti:
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Responsabile del progetto:
P. J. L. Lagoda