Rapporti oncologici

Introduzione

Le specie reattive dell’ossigeno (ROS) sono molecole altamente instabili e reattive contenenti parti di ossigeno. Includono perossido di idrogeno(H2O2), anione superossido (O2●−) e radicale idrossilico (●OH).Sebbene i ROS siano riconosciuti come agenti citotossici, possono servire come messaggeri secondi per controllare molti eventi cellulari di geneexpression, differenziazione, proliferazione cellulare e morte cellulare(1,2)., I ROS sono generati continuamente dal metabolismo aerobico endogeno all’interno delle cellule sotto forma di theO2●− e/o sono appositamente realizzati da ossidasi,come nicotinamide adenina dinucleotide fosfato (NADPH) ossidasee xantina ossidasi (3).O2●− viene convertito inH2O2 dall’enzima superossido dismutasi (4). H2O2 viene ulteriormente trasformato in O2 e H2O da catalaseo glutatione perossidasi (5).Rispetto ad altri membri di ROS, non radicalH2O2 è in grado di penetrare liberamente le membrane cellulari e interagisce con il ferro ferroso (chimica Fenton), che produce l’altamente distruttivo e di breve durata●OH., La produzione di diverse forme di ROS in varii livelli possono essere utili o dannosi per cellule e tessuti.In particolare, quantità eccessive di ROS possono essere il risultato di oithertheir sovrapproduzione e / o downregulation di antiossidanti.L’aumento dei livelli di ROS può causare danni al DNA, alle proteine elipidi nelle cellule, implicandoli nell’eziologia di diverse malattie umane, incluso il cancro (6-9).

L’apoptosi è la morte cellulare programmata e si verifica tramite due diverse vie: La via intrinseca mitocondriale e la via estrinseca mediata dal recettore (10)., Il passo chiave nell’apoptosi mediata dal mitocondrio è la traslocazione del citocromec dai mitocondri al citosol e la sua successivainterazione con Apaf-1 e caspasi-9 per formare un complesso(apoptosoma). L’apoptosoma attiva ulteriormente la caspasi esecutiva-3,-6 e -7 (11). Viceversa, la via estrinseca inizia con il legame di ligandi specifici, come TNF-α, TRAIL e Fas ai rispettivi recettori della morte cellulare, che stimolano le attività di caspasi-8 e -3 (12)., Caspase-8 scinde BID, proteina citosolica apro-apoptotica della famiglia Bcl-2, per generare un prodotto troncato, tBID che entra nei mitocondri ediminuisce il potenziale di membrana mitocondriale (MMP;ΔΨM), causando il rilascio del citocromo c. Iltraslocazione di un’altra proteina apoptotica, Bax dal citosol ai mitocondri innesca anche una simile perdita di MMP(ΔΨM). La caspasi-3 è la caspasi esecutiva chiave; la sua attivazione può smontare sistematicamente l’integrità delle celluleattraverso la scissione di diverse proteine chiave, come la poli(ADP-ribosio)polimerasi (PARP) e RhoGDI.,

I polmoni sono suscettibili a una varietà di lesioni trasportate dall’aria e dal sangue che possono di conseguenza causare fibrosi polmonare e cancro (13). La carcinogenesi del cancro del polmone è considerata strettamente legata ainfiammazione tissutale mediata da H2o2. Durante l’infiammazione, si prevede che le concentrazioni tissutali di H2O2 raggiungano livelli quasi millimolari, mentre si ipotizza che i livelli bassi di H2O2 prodotti dalle ossidazioni NADPH in condizioni normali non abbiano un effetto superiore al microambiente della membrana plasmatica, come i lipidi (14,15)., Nondimeno,in entrambi i casi, H2O2 può modulare le funzioni cellulari vitali della proliferazione cellulare, della morte e della differenziazione modificando le cascate di segnalazione e l’espressione genica e i suoi livelli più elevati possono portare aapoptosi e / o necrosi. L’H2O2 esogeno èfrequentemente usato come ROS rappresentativo per simulare lo stress ossidativo nelle cellule e nei tessuti. H2O2 isrelativamente non tossico per le cellule normali delle cellule ombelicali veneendoteliali umane e delle cellule muscolari lisce dell’arteria polmonare umana(16,17). H2O2-la morte cellulare innescata nelle cellule tumorali polmonari può avere un interesse citotossicologico per la ricerca.,

Nel presente studio, gli effetti molecolari di H2O2 esogeno sulle cellule del cancro del polmone Calu-6 e A549 sono stati valutati in relazione alla crescita e alla morte cellulare, così come gli effetti anti-apoptotici di vari inibitori della caspasi sono stati esaminati nelle cellule del cancro del polmone trattate con H2O2.,

Materiali e metodi

coltura Cellulare

Il cancro del polmone umano Calu-6 e cellulare A549 lineswere acquistato dal coreano Linea Cellulare di Banca (Seul, Corea) andwere coltivato in RPMI-1640 medium supplementato con 10% fetalbovine siero (FBS; Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Germania)e 1% di penicillina-streptomicina (Gibco-BRL; Termo FisherScientific, Inc., Waltham, MA, Stati Uniti d’America). Queste cellule sono state regolarmente coltivate in piatti di coltura di tessuti di plastica da 100 mm (Nunc, Roskilde, Danimarca) e raccolte con una soluzione di tripsina-EDTA (Gibco-BRL;Thermo Fisher Scientific, Inc.).,

Reagenti

Crescita cellulare e numero di cellule test

Le variazioni di crescita cellulare sono state valutate valutando l’assorbanza del colorante 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2, 5-difeniltetrazolio bromuro (MTT;Sigma-Aldrich; Merck KGaA) come descritto in precedenza(19). I numeri di cellule vitali e morte sono stati determinati con il metodo di colorazione delle cellule blu di tripano (20). Le cellule sono state esposte alle quantità designate di H2O2 con o senza 15 µM di ciascun inibitore della casasi per 24 ore.,

Il ciclo cellulare e l’analisi delle cellule sub-G1

Il ciclo cellulare e l’analisi delle cellule sub-G1 sono stati eseguiti con la colorazione di propidio ioduro (PI; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) come precedentemente descritto (20). Le cellule sono state esposte alle quantità designate diH2O2 con o senza 15 µM di ciascun caspaseinhibitor per 24 h. Le distribuzioni del ciclo cellulare sono state analizzate con il citometro a flusso aFACStar (Becton-Dickinson and Company, FranklinLakes, NJ, USA).,

Annexin V-FITC coloring for cell deathdetection

La morte cellulare apoptotica è stata verificata misurando cellsstained con Annexin V-fluoresceina isotiocianato (FITC; Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) come descritto in precedenza(20). Le cellule sono state esposte a quantità designate di H2O2 con o senza 15µM di ciascun inibitore della caspasi per 24 ore. La colorazione di Annexin V-FITC è stata analizzata con un citometro a flusso FACStar (Becton-Dickinson e società).,

La valutazione di MMP(ΔΨM)

MMP (ΔΨM) è stata valutata da un colorante fluorescente rhodamine123 (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) come precedentemente descritto (21). Le celle sono state exposedto le quantità designate di H2O2 con owithout 15 µM di ogni inibitore di caspase per 24 h. Rhodamine 123staining l’intensità è stata analizzata da un citometro di flusso di FACStar (Becton-Dickinson e società). L’assenza di rodamina 123 dale cellule indicavano la perdita di MMP (ΔΨm) nel cancro ai polmonicellule., I livelli di MMP (ΔΨM) nelle cellule che non includevano le cellule a perdita di MMP(ΔΨM) sono stati espressi come intensità media di fluorescenza, stimata dal software CellQuest (versione 5.1;Becton-Dickinson and Company).

Analisi Western blot

I cambiamenti nelle cellule trattate con Bcl-2, caspasi-3 e PARP inH2O2 sono stati analizzati da westernblotting. In breve, 1 × 106 cellule nel piatto di coltura da 60 mm(Nunc) sono state incubate con le quantità designate diH2O2 per 24 h. I campioni contenenti 20 µg di totalproteina sono stati separati da 8 o 12.,Gel 5% SDS-PAGE, trasferito a membrane Immunon-P PVDF (EMD Millipore, Billerica, MA, USA) mediante elettroblotting e poi sondato con anticorpi anti-Bcl-2, anti-caspasi-3,anti-PARP e anti-β-actina (diluizione 1:5.000; Santa CruzBiotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Le membrane sono state trattate con anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano (diluizione1: 5.000; Cell signaling Technology, Inc.). Le macchie sono state sviluppate damezzi di un kit ECL (Amersham Life Science, Arlington Heights, IL,USA).,

Quantificazione delle attività di caspase-3 e −8

Le attività di caspase-3 e -8 sono state valutate dai kit di analisi colorimetriche di caspase-3 e -8 (R&D Systems, Inc.) come precedentemente descritto (20). Inbrief, 1 × 106 cellule in piatto di coltura da 60 mm (Nunc) sono state trattate con 75 µM H2O2 per 24 h. Campioni contenenti 50 µg di proteine totali sono stati utilizzati per valutare le attività di caspasi-3 e-8.

Analisi statistica

I dati che rappresentano almeno due esperimenti indipendenti (media ± SD) sono stati analizzati attraverso il software InStat (GraphPad Prism4; GraphPad Software, Inc.,, San Diego, CA, Stati Uniti d’America). Il t-test dello studente o l’analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) con analisi postoc utilizzando il test di confronto multiplo di Tukey è stato utilizzato per dati parametrici. P < 0.05 è stato considerato per indicare una differenza astatisticamente significativa.

Risultati

H2O2 influenza la crescita cellulare e la distribuzione del ciclo nelle cellule tumorali polmonari

Gli effetti cellulari di H2O2 sulla crescita delle cellule tumorali polmonari sono stati esaminati a 24 h., Treatmentwith 50-250 µM H2O2 significativamente reducedviable (trypan blu-negativo) e aumentato morto (trypanblue-positivo) Calu-6 celle in un modo dose-dipendente (Fig. 1 BIS). Basato su saggi MTT, 50-250 µMH2O2 ha attenuato significativamente la crescita delle cellule CALU-6 con un IC50 di ~ 50 µM (Fig. 1 TER). Quando è stata esaminata la distribuzione del ciclo cellularein cellule Calu-6 trattate con H2O2, le cellule Calu-6 trattate con H2O2 da 75 µM hanno dimostrato un significativo arresto della fase G1 del ciclo cellulareconfrontato con le cellule di controllo (Fig.2 BIS e B)., Come in Calu-6, dopo il trattamento con H2O2, il numero di cellule vitali A549 è diminuito e le cellule morte sono aumentate significativamente in modo dose-dipendente (Fig. 1C). Inoltre, H2O2 dose-dipendente ha ridotto la crescita dicellule a549 con un IC50 di ~ 100 µM (Fig. 1D). Il trattamento con 100 µMH2O2 ha anche indotto significativamente un G1-phasearrest nelle cellule A549 rispetto alle cellule di controllo (Fig. 2 BIS e B).

H2O2 influencescell death e MMP (ΔΨm) inh2o2-treated lung cancer cells

Successivamente, il ruolo di H2O2in lung cancer cell death was further investigated to gain moreunderstanding., Mentre 50-100 µM H2O2 ha aumentato significativamente le percentuali di cellule sub-G1 in Calu-6cells, 250 µM H2O2 non ha aumentato la percentuale di cellule sub-G1 in queste cellule (Fig. 2 BIS e C). Tuttavia, il trattamento con50-250 µM H2O2 dose-dipendente ha aumentato il numero di cellule macchiate di Annexina V-FITC in cellule Calu-6 (Fig. 3 BIS). Quando l’effetto ofH2O2 su MMP (ΔΨM) in Calu-6 cellswas valutato usando rhodamine 123, H2O2provoked la perdita di MMP (ΔΨM) in un dose-dependentmanner (Fig. 3 TER)., Per quanto riguarda il livello di toMMP (ΔΨm) nelle cellule Calu-6 escluse le cellule di colorazione negativerhodamine 123, il livello di MMP (ΔΨM) di H2O2 è diminuito nelle cellule Calu-6 in un fattore dose-dipendente (Fig. 3 QUATER). Nelle cellule A549, il trattamento di 50 e 100 µM H2O2 in modo significativoaumentato le percentuali di cellule sub-G1, ma il trattamento con 250e 500 µM H2O2 non ha mostrato questo effetto(Fig. 2 BIS e C).H2O2 dose-dipendente migliorato il numero diAnnexin V-FITC-macchiato cellule A549 (Fig.3D). Inoltre, H2O2 dose-dependentlyinduced la perdita di MMP (ΔΨM) in cellule A549 (Fig. 3 E)., Mentre 50 µMH2O2 hanno aumentato il livello di MMP (ΔΨM) nelle cellule a549, 100-250 µM H2O2 hanno ridotto significativamente i livelli di MMP (ΔΨM) in queste cellule (Fig. 3 SEPTIES).

H2O2 influenzeproteine correlate all’apoptosi e caspasi nelle cellule tumorali polmonari trattate con 2o2

La valutazione delle proteine correlate all’apoptosi durante la morte delle cellule polmonari indotte da 2o2 ha rivelato CHEBCL-2, una proteina anti-apoptotica, ha ridotto il trattamento con uponH2O2 nelle cellule Calu-6 (Fig. 4 BIS). Il livello di pro-caspasi-3 eraridotto da 75 µM H2O2 (Fig. 4 BIS). La forma ininterrotta di 116 kDa PARP non è stata alterata da H2O2 (Fig. 4 BIS)., L’attività della caspasi-3 è risultata aumentata nelle cellule Calu-6 trattate con H2O2, mentre quella della caspasi-8 non è stata significativamente modificata(Fig. 4 TER). Il trattamento con 50-100 µMH2O2 sembrava diminuire i livelli di proteina Bcl-2,pro-caspasi-3 e PARP nelle cellule A549 (Fig. 4 QUATER). In particolare, 100 µMH2O2 hanno mostrato una marcata diminuzione dei livelli di queste proteine. Trattamento con 75 µM h2o2aumentato significativamente l’attività della caspasi-3 nelle cellule A549 eaumentato significativamente l’attività della caspasi-8 (Fig. 4D).,

Gli inibitori delle caspasi influenzano la crescita cellulare e la morte nelle cellule di cancro ai polmoni trattate con H2O2

Successivamente abbiamo cercato di decifrare il ruolo delle caspasi individuali nella morte delle cellule indotte da H2O2 a 24 h nelle linee cellulari del carcinoma polmonare. Le cellule Calu-6 e A549 sono state pre-incubate con 15 µM di inibitore della caspasi per 1 ora prima del trattamento con 75 o 100 µM H2O2. Nessuno degli inibitori della caspasi testati ha influenzato l’inibizione della crescita indotta da H2O2 in entrambe le linee cellulari Calu-6 e A549(Fig. 5A e D)., Tuttavia, tutti gli inibitori della casasi testati nel Calu-6 trattato con H2O2 hanno ridotto le percentuali di cellule sub-G1 al livello delle cellule di controllo (Fig. 5 TER). Inoltre, il trattamento con tutti gli inibitori della caspasi testati ha ridotto significativamente il numero di cellule macchiate di annexina V-FITC nelle cellule Calu-6 trattate con 2o2, ma l’effetto diminuito era più debole rispetto alla diminuzione delle cellule sub-G1(Fig. 5 QUATER). Tutti i caspaseinhibitors hanno notevolmente salvato le cellule A549 dalla morte cellulare H2o2-promossa, come valutato dalla popolazione di cellule sub-G1 (Fig.5 E)., Inoltre, questi inibitori hanno ridotto significativamente il numero di cellule A549 trattate con Annexina V-FITC (Fig. 5 SEPTIES). Ogni inibitore della caspasi ha avuto effetti anti-morte molto simili nelle cellule tumorali polmonari trattate con H2O2.

Gli inibitori della caspasi influenzano MMP(ΔΨM) nel cancro polmonare trattato con H2O2LE cellule

La morte cellulare è fortemente associata al collasso di MMP (ΔΨM) (22).Pertanto, MMP (Δmm) in cellule tumorali polmonari trattate con 75 o 100 µMH2O2 è stato determinatocon o senza ciascun inibitore della caspasi a 24 h., Tuttavia, tutti gli inibitori di thecaspase non hanno ridotto significativamente la perdita di MMP (ΔΨm)nelle cellule Calu-6 trattate con H2O2 (Fig. 6 BIS). Inoltre, la maggior parte di questi inibitori non ha influenzato il livello MMP (ΔmM) nelle cellule Calu-6 trattate con H2O2. Tuttavia, l’inibitore della caspasi – 9 (Z-LEHD) sembrava aumentare la diminuzione del livello in queste cellule (Fig. 6B). Nelle cellule A549, tutti gli inibitori della caspasi hanno parzialmente impedito la perdita di MMP (ΔΨm) da parte di H2O2(Fig. 6 QUATER). Cellule A549 trattate con InH2O2, inibitori della caspasi-9selettivamente hanno ulteriormente migliorato la diminuzione del livello MMP (ΔΨM) (Fig. 6D)., Questo inibitoralone ha ridotto significativamente i livelli di MMP (ΔΨM) nelle cellule di controllo Calu-6 e A549 (Fig. 6 TER e D).

Discussione

Il cancro del polmone rappresenta una delle principali cause di mortalità correlata al cancro in tutto il mondo ed è correlato all’attività maligna del ROS. Nel presente studio, exogenousH2O2 è stato utilizzato per generare stress ossidativo nelle cellule tumorali polmonari. Questo studio si è concentrato sulla definizione dei meccanismi molecolari dell’inibizione della crescita cellulare e della morte cellulare nelle cellule del cancro ai polmoni Calu-6 e A549 trattate con 2o2., Sulla base di saggi MTT, dopo l’esposizione a 24 ore, i valori di ic50 per H2O2 erano ~50 e 100 µM nelle cellule Calu-6 e A549, rispettivamente.H2O2 dose-dipendente aumentato il numero dicellule morte e Annexin V-FITC-macchiato Calu-6 e A549, indicanteche H2O2-indotta morte delle cellule di cancro del polmone si è verificato attraverso apoptosi. Evidentemente, H2O2diminuito i livelli di Bcl-2 e pro-caspasi-3 in entrambi i tipi di cellule.PARP è stato ridotto nelle cellule A549 trattate con H2O2. Inoltre, le attività di caspasi-3 e -8 sono aumentate in entrambi i tipi di cellule trattate con H2O2.L’apoptosi è fortemente correlata al collasso di MMP(ΔΨm) (22).,H2O2 ha innescato la perdita di MMP (ΔΨM) nelle cellule Calu-6 e A549 in un fattore dose-dipendente, indicando che la morte delle cellule del cancro polmonare daH2O2 era strettamente correlata al collasso di MMMP (ΔΨm). Inoltre, H2O2diminuito il livello MMP (Δmm) nelle cellule del cancro del lungocontenente il colorante rodamina 123.

Sebbene 50-100 µM H2O2 aumentassero significativamente le percentuali di Calu-6 sub-G1 e cellule A549, 250 o 500 µM H2O2 non dimostrarono un effetto simile, indicando che le dosi più elevate diH2O2 fissavano queste cellule tumorali polmonari in modo simile all’etanolo o al metanolo., Così, H2O2 è sembrato indurre il celldeath del cancro polmonare simultaneamente via la necrosi e l’apoptosi, secondo itsconcentration. In particolare, 75 e 100 µMH2O2 sembravano innescare contemporaneamente sia l’apoptosi che la necrosi nelle cellule Calu-6, poiché queste dosi diH2O2 non hanno aumentato le percentuali dicellule sub-G1 rispetto a 50 µM H2O2-trattatecellule, così come non vi è stato alcun cambiamento nei livelli dell’intactform della proteina PARP. È necessario valutare l’attività del lattato extracellulare deidrogenasi nelle cellule del cancro del lungostreato con 50-500 µM H2O2 per il rilevamento della morte cellulare necrotica., Studi precedenti hanno rivelato un ruolo dell’H2O2 nell’arresto e nella progressione della fase del ciclo cellulare regolando le proteine correlate al ciclo cellulare (23,24).In linea con ciò, il trattamento con 75 o 100 µMH2O2 tra le dosi testate ha mostrato in modo significativo un arresto di fase G1 nelle cellule Calu-6 e A549. Così, l’arresto di G1phase insieme con induzione di morte di cella è il potentialmechanism dietro l’attenuazione di crescita di cella uponH2O2 il trattamento. Tuttavia, H2O2 non ha effettuato alcun arresto di fase specifico del ciclo cellulare nelle cellule HeLa (20)., Questi risultati hanno indicato che lo stress ossidativo indotto da 2O2 manifestava i suoi effetti sulla progressione del ciclo cellulare a seconda del tipo di cellula e della dose di H2O2.

Gli inibitori della caspasi utilizzati in questo esperimento non sono riusciti ad attenuare l’inibizione della crescita nelle cellule tumorali Calu-6 e A549 trattate con 2o2,mentre questi inibitori hanno notevolmente impedito la morte cellulare indotta da H2o2 in queste cellule.Sebbene H2O2 in una certa misura abbia aumentato l’attività della caspasi – 8 in entrambe le cellule tumorali polmonari, caspasi-8inhibitor ha attenuato significativamente la morte cellulare innescata daH2O2., Pertanto, una leggera alterazione dell’attività della caspasi-8 sembrava avere un forte impatto sulla via pro-apoptotica nelle cellule lungcancer trattate con H2O2. Questi risultati hanno anche indicato che entrambe le vie del recettore della morte cellulare e mitocondriale erano reciprocamente necessarie per l’induzione dell’apoptosi nelle cellule tumorali del lung trattate con H2O2. Sarebbe importante accertare howH2O2 colpisce il pathwayto del ricevitore della morte delle cellule indurre l’apoptosi in cellule tumorali polmonari. Per quanto riguarda MMP(ΔΨm), gli inibitori della caspasi non hanno avuto alcun effetto significativo sulla perdita di MMP (ΔΨm) nelle cellule Calu-6 e A549 trattate con 2o2., Inaddition, questi inibitori non hanno ristabilito i livelli diminuiti di MMP(ΔΨm) in cellule lungcancer H2O2-trattate. Invece, l’inibitore della caspasi-9 ha migliorato i livelli diminuiti in queste cellule. È plausibile che la perdita di MMMP(ΔΨM) dopo il trattamento CONH2O2 abbia attivato varie caspasi correlate alle vie del recettore della morte cellulare e mitocondriale, inducendo di conseguenza l’apoptosi e l’attivazione di caspasi byH2O2 non potrebbe migliorare positivamente la perdita di MMP (ΔΨM)., Inoltre, la perdita di MMP (ΔΨM) indotta da H2O2 potrebbe non essere sufficiente a provocare completamente l’apoptosi nelle cellule Calu-6 e A549 sotto la downregulation dell’attività della caspasi.

In conclusione, H2O2 inibitedthe crescita delle cellule tumorali del polmone attraverso la morte cellulare e G1-phasearrest del ciclo cellulare. La morte delle cellule Calu-6 e A549 causata daH2O2 è risultata dalla necrosi, così comeapoptosi dipendente dalla fase (Fig.7). I risultati presentati forniscono informazioni utili per comprendere l’effetto citotossicologico di exogenousH2O2 sulle cellule tumorali polmonari in relazione alla crescita cellulare e alla morte., Inoltre, le nuove strategie per il trattamento del cancro del polmone basate sull’uso di H2O2 possono essere utili per ridurre la mortalità correlata a questalignità.

Riconoscimenti

Non applicabile.

Finanziamento

Il presente studio è stato sostenuto da una sovvenzione della National Research Foundation of Korea (NRF) finanziata dal Koreangovernment (MSIP; 2016R1A2B4007773) e sostenuta dal ‘ResearchBase Construction Fund Support Program’ finanziato da Chonbuk NationalUniversity nel 2018.,

Disponibilità di dati e materiali

Tutti i dati generati o analizzati durante questo studio sono inclusi in questo articolo pubblicato.

Contributi degli autori

WHP è stato l’unico contributore alla concezione e progettazione, acquisizione dei dati, analisi e interpretazione dei dati e scrittura del manoscritto. La WHP è responsabile di tutti gli aspetti del lavoro per garantire che le questioni relative all’accuratezza o all’integrità di qualsiasi parte del lavoro siano adeguatamente indagate e risolte.

Approvazione etica e consenso per partecipare

Non applicabile.,

Consenso del paziente alla pubblicazione

Non applicabile.

Interessi concorrenti

L’autore dichiara di non avere interessi concorrenti.,-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromuro

FITC

fluoresceina isotiocianato

PI

ioduro di propidium

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