Il gene 16S rRNA viene utilizzato per studi filogenetici in quanto è altamente conservato tra diverse specie di batteri e archaea. Carl Woese (1977) ha aperto la strada a questo uso di 16S rRNA. È suggerito che il gene di 16S rRNA può essere usato come orologio molecolare affidabile perché le sequenze di 16S rRNA dai lignaggi batterici lontanamente relativi sono indicate per avere simili funzionalità. Alcuni archaea termofili (ad esempio ordine Thermoproteales) contengono introni del gene 16S rRNA che si trovano in regioni altamente conservate e possono avere un impatto sulla ricottura di primer “universali”., Anche gli rRNA mitocondriali e cloroplastici sono amplificati.
La coppia di primer più comune è stata ideata da Weisburg et al. (1991) ed è attualmente indicato come 27F e 1492R; tuttavia, per alcune applicazioni ampliconi più brevi possono essere necessari, ad esempio per 454 sequenziamento con titanio chimica la coppia di primer 27F-534R che copre V1 a V3.Spesso viene utilizzato 8F anziché 27F. I due primer sono quasi identici, ma 27F ha una M invece di una C. AGAGTTTGATCMTGGCTCAG rispetto a 8F.,
| Nome primer | Sequenza (5′-3′) | Rif.,td> | |
|---|---|---|---|
| 805R | GAC TAC CAG GGT ATC TAA TC | ||
| 533F | GTG CCA GCM GCC GCG GTA A | ||
| 518R | GTA TTA CCG CGG CTG CTG G | ||
| 1492R | CGG TTA CCT TGT TAC GAC TT |
PCR and NGS applicationsEdit
In addition to highly conserved primer binding sites, 16S rRNA gene sequences contain hypervariable regions that can provide species-specific signature sequences useful for identification of bacteria.,Di conseguenza, il sequenziamento del gene 16S rRNA è diventato prevalente nella microbiologia medica come alternativa rapida ed economica ai metodi fenotipici di identificazione batterica. Anche se è stato originariamente utilizzato per identificare i batteri, 16S sequenziamento è stato successivamente trovato per essere in grado di riclassificare i batteri in completamente nuove specie, o anche genera.It è stato anche usato per descrivere nuove specie che non sono mai state coltivate con successo.,Con il sequenziamento di terza generazione in arrivo in molti laboratori, l’identificazione simultanea di migliaia di sequenze rRNA 16S è possibile in poche ore, consentendo studi metagenomici, ad esempio della flora intestinale.
Regioni ipervariabilimodifica
Il gene batterico 16S contiene nove regioni ipervariabili (V1–V9), che vanno da circa 30 a 100 coppie di basi, che sono coinvolte nella struttura secondaria della piccola subunità ribosomiale., Il grado di conservazione varia ampiamente tra le regioni ipervariabili, con regioni più conservate correlate alla tassonomia di livello superiore e regioni meno conservate a livelli inferiori, come genere e specie. Mentre l’intera sequenza 16S consente il confronto di tutte le regioni ipervariabili, a circa 1.500 coppie di basi può essere proibitivo per gli studi che cercano di identificare o caratterizzare diverse comunità batteriche., Questi studi utilizzano comunemente la piattaforma Illumina, che produce letture a tassi di 50 volte e 12.000 volte meno costosi di 454 pyrosequencing e Sanger Sequencing, rispettivamente. Mentre più economico e consentendo una copertura più profonda della comunità, Illumina sequencing produce solo letture 75-250 coppie di basi lunghe (fino a 300 coppie di basi con Illumina MiSeq), e non ha alcun protocollo stabilito per assemblare in modo affidabile il gene completo in campioni di comunità. Le regioni ipervariabili complete possono essere assemblate da una singola corsa Illumina, tuttavia, rendendole obiettivi ideali per la piattaforma.,
Mentre le regioni ipervariabili 16S possono variare notevolmente tra i batteri, il gene 16S nel suo complesso mantiene una maggiore omogeneità di lunghezza rispetto alla sua controparte eucariotica (RNA ribosomiale 18S), che può facilitare gli allineamenti. Inoltre, il gene 16S contiene sequenze altamente conservate tra regioni ipervariabili, consentendo la progettazione di primer universali in grado di produrre in modo affidabile le stesse sezioni della sequenza 16S attraverso diversi taxa. Sebbene nessuna regione ipervariabile possa classificare con precisione tutti i batteri dal dominio alla specie, alcuni possono prevedere in modo affidabile specifici livelli tassonomici., Molti studi comunitari selezionano regioni ipervariabili semi-conservate come il V4 per questo motivo, in quanto può fornire una risoluzione a livello di phylum con la stessa precisione del gene 16S completo. Mentre le regioni meno conservate lottano per classificare nuove specie quando la tassonomia di ordine superiore è sconosciuta, sono spesso utilizzate per rilevare la presenza di patogeni specifici. In uno studio condotto da Chakravorty et al. nel 2007, gli autori hanno caratterizzato le regioni V1–V8 di una varietà di agenti patogeni al fine di determinare quali regioni ipervariabili sarebbero più utili da includere per saggi specifici per malattia e ampi., Tra le altre scoperte, hanno notato che la regione V3 era la migliore nell’identificare il genere per tutti i patogeni testati e che V6 era la più accurata nel differenziare le specie tra tutti i patogeni osservati da CDC testati, incluso l’antrace.
Mentre l’analisi della regione ipervariabile 16S è un potente strumento per gli studi tassonomici batterici, fatica a distinguere tra specie strettamente correlate. Nelle famiglie Enterobacteriaceae, Clostridiaceae e Peptostreptococcaceae, le specie possono condividere fino al 99% di somiglianza di sequenza attraverso l’intero gene 16S., Di conseguenza, le sequenze V4 possono differire solo di pochi nucleotidi, lasciando i database di riferimento incapaci di classificare in modo affidabile questi batteri a livelli tassonomici inferiori. Limitando l’analisi 16S per selezionare regioni ipervariabili, questi studi possono non osservare le differenze nei taxa strettamente correlati e raggrupparli in singole unità tassonomiche, sottovalutando quindi la diversità totale del campione. Inoltre, i genomi batterici possono ospitare più geni 16S, con le regioni V1, V2 e V6 che contengono la maggiore diversità intraspecie., Sebbene non sia il metodo più preciso per classificare le specie batteriche, l’analisi delle regioni ipervariabili rimane uno degli strumenti più utili a disposizione degli studi comunitari sui batteri.