Che cos’è RNA-seq?
RNA-seq (RNA-sequencing) è una tecnica che può esaminare la quantità e le sequenze di RNA in un campione utilizzando next generation sequencing (NGS). Analizza il trascrittoma dei modelli di espressione genica codificati all’interno del nostro RNA. Qui, vediamo perché RNA-seq è utile, come funziona la tecnica e il protocollo di base che è comunemente usato oggi1.
Quali sono le applicazioni di RNA-seq?,
RNA-seq ci permette di indagare e scoprire il trascrittoma, il contenuto cellulare totale di RNA tra cui mRNA, rRNA e tRNA. Comprendere il trascrittoma è fondamentale se vogliamo collegare le informazioni sul nostro genoma con la sua espressione proteica funzionale. RNA-seq può dirci quali geni sono attivati in una cellula, qual è il loro livello di espressione e in quali momenti vengono attivati o disattivati2. Ciò consente agli scienziati di comprendere più a fondo la biologia di una cellula e valutare i cambiamenti che possono indicare la malattia., Alcune delle tecniche più popolari che utilizzano RNA-seq sono la profilazione trascrizionale, l’identificazione SNP, l’editing dell’RNA e l’analisi differenziale dell’espressione genica 3.
Questo può dare ai ricercatori informazioni vitali sulla funzione dei geni. Ad esempio, il trascrittoma può evidenziare tutti i tessuti in cui viene espresso un gene di funzione sconosciuta, che potrebbe indicare quale sia il suo ruolo. Cattura anche informazioni su eventi di splicing alternativi (Figura 1), che producono trascritti diversi da una singola sequenza genica. Questi eventi non sarebbero stati rilevati dal sequenziamento del DNA., Può anche identificare le modifiche post-trascrizionali che si verificano durante l’elaborazione dell’mRNA come la poliadenilazione e il capping 5’2.
Figura 1: RNA-seq data uses utilizza brevi letture di mRNA che è privo di DNA intronico non codificante. Queste letture devono quindi essere allineate al genoma di riferimento.
Come agisce RNA-seq?
Le prime tecniche di RNA-seq utilizzavano la tecnologia di sequenziamento Sanger, una tecnica che, sebbene innovativa all’epoca, era anche a basso throughput, costosa e imprecisa., Solo recentemente, con l’avvento e la proliferazione della tecnologia NGS, siamo stati in grado di sfruttare appieno il potenziale di RNA-seq4.
Il primo passo nella tecnica consiste nel convertire la popolazione di RNA da sequenziare in frammenti di cDNA (una libreria di cDNA). Ciò consente all’RNA di essere inserito in un flusso di lavoro NGS. Gli adattatori vengono quindi aggiunti a ciascuna estremità dei frammenti. Questi adattatori contengono elementi funzionali che consentono il sequenziamento; ad esempio, l’elemento di amplificazione e il sito di sequenziamento primario., La libreria cDNA viene quindi analizzata da NGS, producendo brevi sequenze che corrispondono a una o entrambe le estremità del frammento. La profondità a cui viene sequenziata la libreria varia a seconda delle tecniche per cui verranno utilizzati i dati di output. Il sequenziamento segue spesso metodi di sequenziamento single-read o paired-end. Il sequenziamento a lettura singola è una tecnica più economica e veloce (per riferimento, circa l ‘ 1% del costo del sequenziamento Sanger) che sequenzia il cDNA da una sola estremità, mentre i metodi accoppiati-end sequenziano da entrambe le estremità, e sono quindi più costosi e dispendiosi in termini di tempo5,6.,
Un’ulteriore scelta deve essere fatta tra protocolli specifici e non specifici. Il primo metodo significa che le informazioni su cui è stato trascritto il filamento di DNA vengono mantenute. Il valore delle informazioni extra ottenute dai protocolli specifici del filo li rende l’opzione favorevole.
Queste letture, di cui ci saranno molti milioni entro la fine del flusso di lavoro, possono quindi essere allineati ad un genoma di riferimento e assemblati per produrre una mappa sequenza di RNA che attraversa il trascrittome7.,
RNA-seq vs microarray: Perché RNA-seq è considerato superiore
RNA-seq è ampiamente considerato superiore ad altre tecnologie, come l’ibridazione microarray. Ci sono diverse ragioni per lo stato ben considerato di RNA-seq
Un protocollo di RNA-seq Pianificazione dell’esperimento
Preparazione prima di iniziare l’esperimento di RNA-seq è essenziale. Domande a cui rispondere prima di iniziare include10:
• * Quale metodo di purificazione dell’RNA stai usando?
* Quante letture ti serviranno?
•* Quale piattaforma userete?,
•Quale genoma di riferimento userete?
•Come stai valutando la qualità del tuo RNA?
•Avete bisogno di arricchire il vostro RNA bersaglio?
•Vuoi codice a barre il vostro RNA?
•* Ho abbastanza repliche biologiche e tecniche?
•Sequenziamento single-read o paired-end?
Preparazione della libreria cDNA
Dopo aver considerato questi punti, è possibile iniziare a preparare la libreria cDNA. Ciò richiederà l’aggiunta delle “sequenze di adattatori” specifiche della piattaforma e l’amplificazione del DNA, ma la procedura esatta sarà molto specifica per la piattaforma utilizzata in questa fase., L’amplificazione del DNA comporta una sintesi del primo filamento mediata dalla trascrittasi inversa seguita da una sintesi del secondo filamento mediata dalla DNA polimerase10, 11.
Sequenziamento cDNA
Una volta preparata la libreria e aggiunti gli adattatori, è possibile utilizzare la piattaforma di sequenziamento scelta per sequenziare la libreria cDNA alla profondità desiderata. Una volta che i dati di trascrizione sono stati prodotti, è possibile mappare i dati al genoma di riferimento., Il processo di allineamento può essere complicato dalla presenza di varianti di giunzione e modifiche, e la scelta del genoma di riferimento utilizzato varierà anche quanto sia difficile questa fase. Pacchetti software come STAR sono utili in questa fase, così come strumenti di controllo qualità come Picard o Qualimap12.
RNA-Seq Analisi dei dati
Dopo la fase di allineamento, è possibile concentrarsi sull’analisi dei dati. Strumenti come Sailfish, RSEM e BitSeq12 ti aiuteranno a quantificare i tuoi livelli di espressione, mentre strumenti come MISO, che quantifica i geni in alternativa, sono disponibili per un’analisi più specialista13., C’è una libreria di questi strumenti là fuori, e la lettura di recensioni e retate sono il modo migliore per trovare lo strumento giusto per la vostra ricerca.
Per riassumere, moderno RNA-seq è ben consolidata come l’opzione superiore a microarray e probabilmente rimarrà l’opzione preferita per il momento.
5.https://systemsbiology.columbia.edu/genome-sequencing-defining-your-experiment
6.https://emea.illumina.com/science/technology/next-generation-sequencing/paired-end-vs-single-read-sequencing.html
9.https://cofactorgenomics.com/advantages-rna-seq-over-microarray-technology/
10.http://bioinformatics.ucdavis.edu/docs/2015-june-workshop/_downloads/Th_MB_RNASeq_Intro.pdf
11.https://rnaseq.uoregon.edu/#library-prep-stranded-libraries