Animali
Tutti gli esperimenti sono stati condotti utilizzando topi C57 / B6 maschi e femmine non riproduttori (di età compresa tra 2 e 3 mesi). Ogni sesso ha contribuito a circa la metà del numero totale di animali in ogni esperimento. Gli animali erano alloggiati in un ciclo buio / luce di 12/12 h e avevano accesso illimitato a cibo e acqua., L’uso di topi in questi esperimenti era in conformità con la Guida per la cura e l’uso di animali da laboratorio e protocolli sperimentali sono stati approvati dalla University of Southern California Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
Esposizione alla luce
Gli occhi sono stati dilatati con soluzione oftalmica Tropicamide allo 0,5%, USP (AKORN) e Soluzione oftalmica fenilefrina cloridrato al 2,5%, USP (AKORN). I topi sono stati adattati al buio durante la notte., Sono stati tenuti al buio o esposti a una luce fluorescente bianca fredda diffusa a livello di luminescenza di 5000 lux per 30 min a 1 h prima di essere eutanasia. I campioni adattati al buio per entrambi i metodi sono stati preparati in una camera oscura sotto luce infrarossa e tutte le procedure che hanno coinvolto tessuto adattato al buio sono state eseguite utilizzando un microscopio da dissezione dotato di convertitori a infrarossi (B. E. Meyers & Co, Inc.). I campioni esposti alla luce sono stati elaborati sotto un ambito di dissezione nella luce della stanza.,
Dissezione della retina
I topi sono stati sottoposti a eutanasia per inalazione di isoflurano seguita da dislocazione cervicale. Gli occhi sono stati enucleati e le retine sono state isolate in una capsula di petri di 35 × 10 mm riempita con l’appropriato tampone/soluzione descritta di seguito. La cornea, il cristallino e l’umore vitreo sono stati rimossi da ciascun occhio e l’epitelio pigmentato retinico (RPE) e la sclera sono stati accuratamente staccati da ciascuna retina. Le retine isolate sono state emisettate con un bisturi di piume in un piatto di 60 × 15 mm e i bordi sono stati tagliati per generare due rettangoli., Ridurre al minimo la curvatura di ogni retina dimezzata ha aiutato ad appiattire la retina e ha assicurato una buccia accurata degli strati retinici. Il corretto taglio dei bordi pieghevoli della retina è essenziale: se la retina ha bordi pieghevoli quando viene posizionata sulla carta da filtro, si tradurrà in una diminuzione della resa di ROS isolati e, cosa più importante, sarà contaminata da altri strati retinici.
Immunocitochimica
Prima dell’enucleazione, il polo superiore della cornea era contrassegnato da cauterizzazione e la cornea, il cristallino e il vitreo venivano successivamente rimossi., Le restanti coppe oculari sono state poste in 4% paraformaldeide in PBS per 15 min e risciacquate 3 volte per 10 min in PBS. Le coppe oculari sono state crioprotette in saccarosio 30% in PBS per 2 h, poste in Tissue-Teck ® O. C. T. compound (Sakura Finetek, USA) e rapidamente congelate in N2 liquido. I blocchi congelati sono stati sezionati a 10 µm in un criostato (CM 3050 S, Leica Microsystems) e conservati a -80 °C. Prima dell’incubazione degli anticorpi, le sezioni sono state equilibrate a temperatura ambiente (RT) per 15 min., Per la colorazione GNAT1 utilizzando l’anticorpo monoclonale di topo TF-15, è stato eseguito il recupero dell’epitopo: le sezioni sono state trattate per 2 min RT con 0,02 mg/ml di proteinasi K in tampone bloccante (2% albumina sierica bovina, 2% siero di capra, 0,3% Triton X-100 in 1X PBS) e riscaldate a 65 °C per 10 s seguite da cinque risciacqui con PBS. Il tampone di blocco è stato quindi applicato a tutte le sezioni per 1 h. Le sezioni sono state incubate con l’anticorpo di coniglio contro ARR1 (C10C10 diluito 1:100 nel tampone di blocco) o TF-15 (CitoSignal, diluito 1:200 nel tampone di blocco)., Le sezioni sono state risciacquate e incubate con un anticorpo secondario marcato con fluoresceina (Vector Laboratories). Tutte le sezioni sono state quindi a doppia colorazione con l’anticorpo biotinilato contro la rodopsina (1D4 diluito 1:300 in tampone bloccante). Le sezioni sono state risciacquate e incubate con rodamina Avidin D (1:100, Vector Laboratories). Le immagini sono state ottenute utilizzando un microscopio Zeiss AxioPlan2. Le condizioni di luce e buio sono state riprese utilizzando tempi di esposizione identici.,
ROS collection by sequential peeling with filter paper
Il metodo di peeling della carta da filtro è stato adattato da una tecnica per esporre le cellule bipolari con tag fluorescenti in un supporto piatto retinico per registrazioni di patch clamp . Staccando gli strati multipli della cellula del fotorecettore con carta da filtro gradualmente espone i dendriti bipolari della cellula ed i corpi delle cellule per accesso più facile per le letture elettriche del morsetto della toppa e di stimolazione. Abbiamo scoperto che i sottoprodotti pelati, gli strati di fotorecettori che sono bloccati sulla carta da filtro, erano suscettibili di successive analisi Western blot.,
Il mezzo di Ames è stato utilizzato per la manipolazione del tessuto retinico vivo (Sigma-Aldrich A1420). Sono stati preparati due diversi tamponi: Ames ‘ – HEPES (a 1 L aggiungere 2,38 g HEPES, 0,877 g NaCl, pH 7,4) e Ames’-bicarbonato (a 1 L aggiungere 1,9 g NaHCO3, pH 7,4). Entrambi sono stati preparati in anticipo, filtrati sterili e conservati a 4 °C. Tutte le procedure sono state eseguite a RT., Prima della dissezione retinica, 50-100 ml di Ames ‘ – HEPES sono stati gorgogliati con il 100% di O2 in un flacone da 100 ml di GibcoTM (Thermo Fisher, USA) e 50-100 ml di Ames’-bicarbonato sono stati gorgogliati con il 95% di O2 e il 5% di CO2 in un contenitore a tenuta di luce per 15-20 minuti prima dell’uso.
Le retine sono state preparate come descritto nella sezione “Dissezione della retina” e conservate in un contenitore a tenuta leggera con bicarbonato di Ames gorgogliato con il 95% di O2 e il 5% di CO2 per mantenere il pH fisiologico., Questa condizione di incubazione è identica a quella utilizzata dai fisiologi della retina per registrazioni di elettroretinogrammi ex vivo o registrazioni di elettrodi di aspirazione e può mantenere la vitalità e la funzionalità del tessuto per diverse ore. Un pezzo dimezzato di retina rettangolare tagliata è stato utilizzato per ogni procedura di peeling. Il tessuto è stato trasferito tramite una pipetta di trasferimento di plastica da 1,7 ml (taglio a punta) in una capsula di petri da 35 × 10 mm contenente Ames-HEPES ossigenato. Il supporto è stato rinfrescato ogni 10 minuti durante il processo di peeling per mantenere lo stato ossigenato., La retina in soluzione è stata orientata con il lato del fotorecettore rivolto verso il basso utilizzando una pinzetta e la pipetta di trasferimento. Un pezzo rettangolare di carta da filtro 5 mm × 2,5 mm tagliato da carta da filtro VWR grade 413 (diametro 5,5 cm, dimensione dei pori 5 µm, VWR, USA) è stato posto nella capsula di petri vicino alla retina. La retina è stata accuratamente spostata con una pinzetta (tenendo leggermente i bordi) sulla carta da filtro con il lato del fotorecettore verso il basso. Una volta che la retina è stata centrata sulla carta da filtro, entrambi sono stati accuratamente sollevati dal Ames’-HEPES., Il lato inferiore della carta da filtro (il lato senza la retina) è stato asciugato su un tovagliolo di carta per assorbire il liquido sulla carta da filtro (2-3 tocchi). Questo ha creato un’adesione sicura tra le cellule fotorecettori e le fibre della carta da filtro, e questo attaccamento era importante per rimuovere lo strato ROS. Una goccia di Ames ‘ – HEPES dalla capsula di Petri è stato posto sulla retina, e la carta da filtro cancellato di nuovo sul tovagliolo di carta. Questo è stato ripetuto per un totale di tre volte., La carta da filtro con la retina è stata quindi riposta nella capsula di petri e sommersa, e il tessuto rimosso dalla carta da filtro con una pinzetta. Si è fatto attenzione a toccare solo il perimetro estremo della retina per preservare l’integrità strutturale della retina. Per facilitare il processo di peeling, i bordi della retina sono stati delicatamente staccati dalla carta da filtro da ciascun lato, allentando l’adesione della retina alla carta da filtro., Una volta che la retina è stata rimossa dalla carta da filtro, la superficie inferiore della carta da filtro è stata macchiata su un tovagliolo di carta e posta in un tubo etichettato +ROS ed è stata mantenuta sul ghiaccio. Il processo di peeling sopra descritto è stato ripetuto circa 7-8 volte. Dopo 5 peeling, la retina divenne più sottile, più trasparente ed era soggetta a strappi. Dopo la pelatura, il tubo +ROS contenente le carte filtranti raccolte e la retina dimezzata sbucciata rimanente è stato posto nel tubo-ROS, congelato su ghiaccio secco e conservato a -80 °C.,
Separazione dei compartimenti fotorecettori mediante peeling della retina liofilizzata
Questo metodo è stato adattato da quello descritto da M. E. Guido, et al. , che ha progettato un metodo di peeling del nastro ScotchTM che ha utilizzato retine di pulcino liofilizzate per separare selettivamente la retina in diversi strati (cellule fotorecettori, strato nucleare interno e cellule gangliari)., Poiché le retine di diversi modelli animali hanno diverse distribuzioni di aste e coni e possono separarsi asimmetricamente con del nastro dopo la liofilizzazione, abbiamo adattato questo metodo ed esplorato la sua utilità per la separazione dei compartimenti delle retine di topo.
Liofilizzazione di retine isolate
Le retine sono state preparate come descritto nella sezione “Dissezione retinica”. Durante la dissezione è stato utilizzato il Cold Ringer (130 mm NaCl, 3,6 mM KCl, 2,4 mm MgCl2, 1,2 mM CaCl2, 10 mm HEPES, 0,02 mM EDTA, pH 7,4). Altri tamponi fisiologici, come Ames’-HEPES, potrebbero anche essere utilizzati., Poiché più campioni venivano spesso trattati contemporaneamente, i pezzi di carta da filtro 5 × 2,5 mm (carta da filtro qualitativa Whatman® Grade 1 (diametro 9 cm, dimensione dei pori 11 µm, GE Healthcare, USA) erano etichettati prima del tempo prima di essere collocati in una capsula di petri riempita con buffer di Cold Ringer. Per ogni campione, un pezzo di retina rettangolare dimezzato è stato posizionato sulla carta da filtro utilizzando una pipetta di trasferimento da 1,7 ml (punta tagliata) con il lato della cellula gangliare verso il basso e il segmento esterno del fotorecettore verso l’alto., Una volta che il tessuto è stato centrato sulla carta da filtro, entrambi sono stati sollevati dal tampone della suoneria e il fondo della carta da filtro (il lato senza la retina su di esso) è stato cancellato su un tovagliolo di carta (2-3 tocchi) per facilitare l’attaccamento dello strato di cellule gangliari sulla carta da filtro. Una goccia di cold Ringer è stata posta sulla retina e il fondo della carta da filtro è stato nuovamente cancellato sul tovagliolo di carta. Questo è stato ripetuto per un totale di tre volte. Il buffer di Ringer è stato sostituito con un nuovo buffer di Ringer freddo dopo ogni preparazione del campione., La carta da filtro con retina attaccata è stata posta in una capsula di petri riempita con la suoneria fredda fino a quando tutti i campioni sono stati elaborati nello stesso modo. Infine, ciascuno è stato nuovamente sollevato dalla soluzione, il fondo della carta da filtro asciugato, e una goccia di PBS freddo posto sulla carta da filtro accanto alla retina, il fondo del filtro di nuovo macchiato, e posto in un pulito e asciutto 35 × 10 mm capsula di petri. Lo scopo di questo passaggio era quello di risciacquare il Ringer più complesso con PBS per ridurre la quantità di sale essiccato sul tessuto liofilizzato., Dopo che tutti i campioni di tessuto erano stati elaborati con questa fase finale di risciacquo e raccolti nella capsula di petri pulita, il piatto è stato avvolto a tenuta di luce con due strati di pezzi quadrati di alluminio da 2,5 × 2,5 pollici, con piccoli fori, in modo che i campioni di retina adattati al buio non siano esposti alla luce e I piccoli fori consentivano l’accesso del liquido N2 all’interno, riempiendo la capsula di petri, e si faceva attenzione a garantire che i fori fossero sfalsati in modo che la capsula di petri fosse avvolta a tenuta di luce., La capsula di petri è stata quindi posta in un pallone Labconco da 600 mL utilizzando un liofilizzatore VirTis Benchtop 2 K (SP Scientific, USA) per 30 min per liofilizzare il tessuto.
Peeling degli strati retinici con nastro ScotchTM
I tessuti retinici liofilizzati sono stati conservati a -80 °C in un contenitore pieno di DrieriteTM (W. A. Hammond Drierite Co, USA) o sono stati isolati come +ROS, +RIS e-ROS / RIS-depleted tissue (- OIS), congelati di nuovo come sopra o trasformati per Western blots lo stesso giorno. Tutte le procedure di peeling sono state eseguite sotto la luce della stanza. Strisce più piccole di 2.,5 mm di larghezza sono stati tagliati e posizionati sul bordo dell’erogatore del nastro fino a quando non sono stati tagliati in pezzi rettangolari. Una retina liofilizzata fissata alla carta da filtro Whatman® è stata posta in una capsula di petri pulita da 10 cm. Un piccolo pezzo rettangolare di nastro ScotchTM (leggermente più grande della superficie del tessuto) è stato tagliato e accuratamente posato sopra la retina liofilizzata. Posizionare il nastro sulla parte superiore della retina liofilizzata era quasi sufficiente per attaccare lo strato ROS arancione colorato al nastro., Per garantire il contatto completo del ROS con il nastro, è stata applicata una leggera pressione con una pinzetta sulla parte superiore del nastro per garantire il contatto con la superficie superiore. Dopo aver accuratamente rimosso il nastro, lo strato ROS colorato di arancio è stato aderito al nastro e separato dal resto della retina. Questa frazione è stata etichettata + ROS e inserita in un tubo di microfuga pulito. Spesso, un sottile film bianco era visibile sulla superficie fratturata dello strato arancione sulla prima buccia del nastro., Questa superficie è stata rimossa da più bucce di nastro fino a quando non è stata completamente rimossa e il colore arancione dello strato ROS è stato portato in superficie. Questo strato bianco inizialmente collegato al ROS è stato inserito in un tubo separato ed etichettato con la frazione +RIS. Il nastro è stato utilizzato per rimuovere il tessuto retinico rimasto dalla carta da filtro ed è stato inserito in un tubo etichettato-OIS., La quantità di pressione applicata al nastro per la buccia iniziale dello strato ROS arancione-colorato influenzato come il campione liofilizzato frazionato; troppa pressione ha causato l’intera retina liofilizzata per staccare la carta da filtro sul nastro e troppo poca pressione non ha separato lo strato superiore arancione dalla retina. Un paio di passaggi sul nastro utilizzando una pressione minima con una pinzetta è stato utile per sentire la quantità minima e massima di pressione da aggiungere alla parte superiore del nastro.,
Preparazione del campione per Western blot: peeling con carta da filtro
I tubi +ROS contenenti la carta da filtro sono stati sottoposti ad una rapida centrifuga in microcentrifuga per 2 s e il liquido in eccesso rimosso. Ogni tubo è stato elaborato singolarmente (una retina dimezzata) o due tubi (due retine dimezzate) sono stati combinati per materiale più concentrato. L’isolato + ROS in un singolo tubo è stato omogeneizzato in 45-60 µL di tampone RIPA freddo (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mm NaCl, 1% Triton X-100, 1% sodio desossicolato, 0,1% SDS, 1 mM EDTA, 0.,1 M PMSF, mini inibitore completo della proteasi (Roche Applied Sciences)), e l’isolato-ROS in un singolo tubo è stato omogeneizzato in un tampone RIPA da 80-100 µL. Quando due tubi sono stati combinati, 80-110 µL di tampone RIPA freddo è stato utilizzato per omogeneizzare + ROS e 100-150 µL di tampone freddo è stato utilizzato per-ROS. Tutti i tubi sono stati omogeneizzati per 1 min con un pestello autoclavato. Grande cura è stata presa per assicurarsi che i pezzi di carta da filtro nei tubi +ROS sono stati tenuti sul lato dei tubi e sono rimasti in contatto con il pestello invece di essere bloccato sul fondo., Dopo l’omogeneizzazione, sono state utilizzate pinzette sterili per spostare i pezzi di carta da filtro sul lato del tubo +ROS, seguito da 2-4 s di spin nel microcentrifugo. Questo spin estratto il liquido dalla carta, e il liquido è stato trasferito in un tubo pulito e trattati per Western blot come descritto di seguito. Questo è stato il passaggio più dispendioso in termini di tempo e, se non eseguito correttamente, gran parte del campione potrebbe finire per essere assorbito dai pezzi di carta da filtro. Per massimizzare il recupero del campione, la dimensione dei pezzi di carta da filtro utilizzati per le bucce deve essere tagliata in modo da corrispondere all’area del tessuto retinico.,
Preparazione del campione: peeling con nastro ScotchTM
Simile al metodo di peeling del filtro, due provette, ciascuna contenente uno strato pelato da metà retina, sono state combinate per aumentare la concentrazione proteica. I campioni +ROS e + RIS sono stati omogeneizzati in 100-115 µL e i campioni-OIS in 125 µL di tampone RIPA freddo. Tutti i tubi sono stati omogeneizzati per 1 min. Grande cura è stata presa per assicurarsi che il nastro nei tubi +ROS, +RIS e-OIS rimanesse in contatto con il pestello e che il nastro fosse mantenuto sul lato dei tubi invece di essere bloccato sul fondo., Dopo l’omogeneizzazione, sono state utilizzate pinzette sterili per spostare pezzi di nastro sul lato dei tubi. I tubi sono stati filati nella mini centrifuga per 2-4 s, dopo di che i pezzi di nastro essiccati sono stati accuratamente rimossi.
Quantificazione delle proteine, elettroforesi su gel e immunoblots proteici
Per determinare la quantità totale di proteine in ciascun campione è stato utilizzato un kit di analisi delle proteine BCA (Thermo Scientific, USA). Due microlitri di DNaseI (10 unità/µL, Roche, Svizzera) sono stati aggiunti ai campioni e sono stati lasciati a temperatura ambiente per 30 min., All’omogenato è stato aggiunto un volume appropriato di tampone campione 4X SDS (40% glicerolo, 240 mM Tris Base pH 6,8, 8% SDS, 5% ßME, 0,04% blu bromofenolo).,tr>
Approximately 10 μg of protein lysate was loaded per lane and separated on a pre-cast polyacrylamide Bis-Tris gel with a 4–12% gradient (Life Technologies, USA) and transferred onto nitrocellulose membrane., Le membrane sono state bloccate in un tampone 10% latte/TBS-T per 1 ora a RT e incubate durante la notte con i seguenti anticorpi:anticorpo anti-ARR1 del coniglio (1:1000, ref), anticorpo monoclonale anti-GNAT1 del topo (TF-15, 1:1000, CitoSignal), anticorpo anti-β actina del coniglio (1: 5000, GeneTex Inc.), coniglio anti-RGS9 anticorpo (1:1000), coniglio anti-Gß5L/S (CT215) (1:2000), e coniglio anti-citocromo C anticorpo policlonale (1: 500, Santa Cruz, sc-7159). Le membrane sono state incubate con anticorpi secondari marcati con fluorescenza (1: 10.000, LI-COR Biosciences) a RT per 1 ora., Le bande proteiche sono state rilevate da Odyssey ® infrared imaging system (LI-COR Biosciences, USA) e l’intensità di fluorescenza delle singole bande è stata quantificata utilizzando ImageJ. I segnali GNAT1, ARR1 e RGS9 sono stati normalizzati contro Gß5L per campioni + ROS, + RIS e contro actina per campioni-ROS e-OIS. Per ogni esperimento indipendente, i segnali fluorescenti per ogni proteina in ogni compartimento sono stati normalizzati anche contro i segnali combinati da tutti i compartimenti retinici. I test t a 2 code non accoppiati sono stati utilizzati per determinare le differenze tra due gruppi.