Il siero bovino fetale (FBS) è la frazione liquida di sangue coagulato dai vitelli fetali, impoverito di cellule, fibrina e fattori di coagulazione, ma contenente un gran numero di fattori nutrizionali e macromolecolari essenziali per la crescita cellulare. L’albumina sierica bovina è il componente principale di FBS. I fattori di crescita in FBS sono essenziali per il mantenimento e la crescita delle cellule coltivate . FBS contiene anche una varietà di piccole molecole come aminoacidi, zuccheri, lipidi e ormoni.
FBS è utilizzato in una vasta gamma di applicazioni., Uno degli usi primari di FBS è nella coltura cellulare eucariotica, con concentrazioni fino al 20% o anche superiori, dove fornisce molti nutrienti essenziali e fattori di crescita che facilitano la sopravvivenza e la proliferazione cellulare. Tuttavia, è importante notare che le FBS nelle colture cellulari umane possono introdurre artefatti di ricerca; le cellule umane coltivate con sieri umani si comportano in modo diverso da quelle coltivate con FBS ., FBS inoltre è utilizzato nella ricerca, nella fabbricazione e nel controllo dei vaccini umani e veterinari e delle droghe biotech ed è usato per fermare la digestione della tripsina o per servire come protectant nella crioconservazione . I mezzi di coltura cellulare senza siero sono in uso da molti anni. Il siero bovino fetale potrebbe non essere il miglior integratore per la coltura cellulare. Ad esempio, l’albumina sierica bovina con selenito di insulina-transferrina-sodio e/o fattore di crescita epidermico nel terreno di coltura migliora la qualità dell’embrione bovino e l’invasione del trofoblasto rispetto al siero bovino fetale .
Il siero fetale contiene più fattori di crescita e ha un contenuto inferiore di gammaglobuline (cioè anticorpi) e siero non fetale. Questi sono importanti perché i fattori di crescita facilitano la sopravvivenza e la proliferazione delle cellule mentre gli anticorpi potrebbero legarsi alle cellule in coltura. Inoltre, il siero fetale contiene livelli più bassi di proteine del complemento (complementi) rispetto a quelli degli adulti o dei neonati. Questi complementi hanno gli effetti indesiderati delle cellule lisanti in coltura e interferiscono con i saggi immunologici.
Il siero e il plasma sono entrambi derivati dal sangue intero utilizzando la centrifugazione per rimuovere i componenti inclusi i globuli rossi. La differenza tra plasma e siero è che le proteine della coagulazione sono presenti nel plasma ma sono state rimosse dal siero. Il plasma viene generalmente preparato aggiungendo anticoagulanti al sangue prima della centrifugazione, ma le proteine della coagulazione non vengono rimosse. Il siero viene preparato permettendo al sangue di coagulare prima della centrifugazione o mediante centrifugazione estesa/progressiva. Pertanto il fibrinogeno e le proteine associate alla coagulazione non sono presenti nel siero.,
gli esseri umani, i seguenti 22 proteine costituiscono il 99% del tenore totale di proteine di siero e plasma: albumina, IgG totali, transferrina, fibrinogeno, un totale di IgA, alfa-2-macroglobulina, totale IgM, alfa-1-antitripsina, C3 del complemento, haptoglobulin, alfa-1-glicoproteina acida, apolipoproteina B, apolipoproteina A1, lipoproteina (a), il fattore H, ceruloplasmina, C4 del complemento, fattore di complemento B, pre-albumina, C9 complemento, C1q del complemento, e C8 complemento . Il restante 1% include centinaia di proteine., La proteina sierica più abbondante, l’albumina, a 50 mg / ml, comprende circa la metà della massa proteica totale .
L’International Serum Industry Association (ISIA; www.serumindustry.org), un’organizzazione commerciale di fornitori di siero, linee guida stabilite per la standardizzazione del controllo di qualità. Queste linee guida richiedono che i seguenti test siano eseguiti utilizzando metodologie specifiche e i risultati dei test devono essere disponibili come Certificato di analisi (Tabella 1).,h>Test
batteri e funghi – test di sterilità
mycoplasma
citopatico agenti virali test
hemadsorbing agenti virali test
bovina virus della diarrea virale test
la misura del pH
osmolarità
proteine totali, determinato da all’analisi del biureto
endotossine
l’emoglobina
elettroforetica pattern
il test delle prestazioni, come le cellule staminali cultura
immunodiffusione radiale
immunoglobuline
gamma-glutamil transferasi (GGT)
Tabella 1., Requisiti minimi del test del siero.
Le endotossine, chiamate anche lipopolisaccaride (LPS) o lipooligosaccaride (LOS), provengono dalle membrane esterne dei batteri Gram-negativi e contribuiscono alle manifestazioni cliniche di una varietà di batteri Gram-negativi patogeni. In vivo, le endotossine inducono la febbre e la risposta infiammatoria mentre nelle colture cellulari introducono variazioni nelle risposte cellulari.
I livelli di endotossina sono misurati mediante il test LAL (limulus amebocyte lysate)., Gli amebociti sono analoghi ai globuli bianchi nei vertebrati e LAL è preparato dal sangue di Limulus polyphemus (granchio a ferro di cavallo americano; Figura 1). LAL è molto sensibile alle endotossine e coagula in presenza anche di una quantità minima di endotossina. Lo stato di conservazione del granchio a ferro di cavallo americano è stato valutato e discusso nella cultura popolare . Molte delle popolazioni di granchi a ferro di cavallo sono a rischio e quindi occorre prestare attenzione per proteggerli dalla perdita.
Discutiamo alcuni dei sieri di specialità comunemente usati di seguito. I preparati serici dedicati a specifici argomenti di ricerca, come il siero carente di lipoproteine di Kalen Biomedical per la ricerca sul colesterolo , o per sistemi di espressione genica specializzati, come il siero bovino fetale schermato da tetraciclina , non sono discussi.
FBS regolare contiene un gran numero di vescicole extracellulari, alcune delle quali sono esosomi ., Quando si esegue la ricerca di esosomi con cellule coltivate è fondamentale utilizzare FBS senza esosomi. Tuttavia, è importante essere consapevoli del fatto che FBS esosoma impoverito può influenzare e sostenere la crescita cellulare in modo diverso rispetto ai normali FBS . FBS esosoma impoverito può essere acquistato direttamente da diversi fornitori commerciali, o preparati attraverso ultracentrifugazione o ultrafiltrazione, anche se gli effetti dei processi di deplezione e/o le fonti commerciali possono non essere coerenti in termini di crescita cellulare e fisiologia .,
Altri componenti di FBS possono essere esauriti, a seconda dei requisiti sperimentali. Ad esempio, Galmozzi A et al ha impoverito l’eme da FBS con acido ascorbico .
Un trattamento comune di FBS è l’inattivazione del calore, dove FBS viene riscaldato a 56°C per 30 minuti a bagnomaria con agitazione occasionale. Lo scopo è quello di inattivare qualsiasi componente del sistema del complemento presente nell’FBS e altri potenziali inibitori sconosciuti della crescita cellulare., In precedenza l’inattivazione del calore aveva anche lo scopo di rimuovere la contaminazione da micoplasma, che non è più un problema poiché tutti i prodotti del siero sono ora filtrati attraverso dimensioni dei pori abbastanza piccole da rimuovere il micoplasma. Va notato che l’inattivazione del calore può avere anche effetti indesiderati, come ridurre la capacità delle cellule coltivate di attaccarsi alle superfici .
Diversi fornitori hanno esortato gli utenti a non riscaldare inattivare FBS per la maggior parte delle esigenze di coltura cellulare., In ogni caso è consigliabile valutare la necessità di inattivazione del calore in una particolare applicazione, poiché diverse cellule hanno risposte diverse verso l’inattivazione del calore di FBS .
Inoltre, come tutti gli altri protocolli per quanto riguarda FBS, il processo di inattivazione del calore deve essere fatto con cura, poiché una temperatura troppo alta o un riscaldamento prolungato inattiverà i fattori di crescita e genererà precipitati.
HY Chew et al hanno mantenuto A431, HCC1569, MCF7, MDA-MB-231, MDA-MB-468, SCC25, SKBR3, T47D, RENCA e CT26.Linee cellulari WT in supporti con FBS inattivato al 10% (v/v)., Freeman SA et al hanno utilizzato FBS inattivato dal calore in tutto il loro studio sui macrofagi . Aikawa T et al hanno coltivato cellule gliali primarie di topo su flaconi rivestiti di poli-D-lisina in DMEM contenenti FBS inattivato al 10% da MilliporeSigma (F2442) . Feldman D et al ha coltivato le cellule HEK293FT in DMEM integrate con siero bovino fetale inattivato dal calore da Seradigm (97068-085) e A549, HCT116, HT1080, cellule A375 con siero bovino fetale inattivato dal calore da Sigma (F4135) per valutare gli schermi combinati ottici ., Kulkarni S et al ha mantenuto le cellule Hut – 78 con siero bovino fetale inattivato dal calore di Atlanta Biologicals .
Il carbone attivo può legarsi alle molecole lipofile e quindi è stato utilizzato per rimuovere ormoni come androgeni, estradiolo, progesterone, cortisolo, testosterone, triiodotironina (T3) e tiroxina (T4) da FBS. Questi ormoni lipidici sierici tendono ad interferire con i sistemi di dosaggio immunologico e i metodi di dosaggio dell’insulina. L Zhao et al hanno misurato la crescita delle cellule tumorali nei terreni di coltura integrati con siero 10% carbone-spogliato .,
Dialisi può rimuovere tutte le molecole con peso molecolare inferiore a 10.000 MW da FBS. Questo include sia molecole polari che non polari. Ormoni, citochine, glucosio, aminoacidi e molti altri vengono rimossi. La dialisi rimuove anche antibiotici e altre molecole esogene in FBS.
FBS dializzato da Thermo Fisher Scientific è stato utilizzato nella coltura di adenocarcinoma duttale pancreatico per lo studio di spec di massa SILAC e altri studi SILAC , e nella coltura di cellule HeLa con Met analogico l-AHA pulse-chase per la rilevazione click-chimica di proteine a vita lunga .,
L’irradiazione gamma può essere parte del processo per sterilizzare FBS. FBS viene solitamente filtrato attraverso filtri 0.1 um più volte per eliminare i microrganismi. L’irradiazione gamma può inattivare i virus comunemente presenti nelle specie bovine. Tuttavia, alcune specie virali, come il parvovirus, sono resistenti all’irradiazione gamma.
Sebbene FBS abbia un contenuto di IgG piuttosto basso, anche questo livello potrebbe essere troppo alto per alcune determinate applicazioni. Il livello di IgG può essere notevolmente ridotto ulteriormente mediante cromatografia di cattura., FBS con IgG basso viene utilizzato per la produzione di anticorpi, sintesi proteica ricombinante e altre applicazioni.
La coltura di cellule staminali ha requisiti rigorosi in termini di fattori di crescita. Alcuni dei fattori di crescita presenti in FBS promuovono la differenziazione delle cellule staminali. Diverse aziende offrono cellule staminali embrionali FBS qualificati destinati a mantenere indifferenziata cellula staminale. Tuttavia, è importante testare lotti specifici di FBS per la loro applicabilità nel mantenere la pluripotenza / totipotenza di diversi tipi di cellule staminali., Thermo Fisher fornisce FBS embrionali con cellule staminali qualificate, come, ad esempio, utilizzato nella coltura cellulare E14TG2a mouse ES di Yasuda S et al .
I principali paesi del bestiame sono i principali fornitori di FBS. I paesi includono Stati Uniti, Australia, Nuova Zelanda, Canada, diversi nelle Americhe meridionali e centrali.
La produzione e la raccolta di prodotti a base di siero sono regolate da agenzie governative. FBS è etichettato come USDA-Grade o europeo-Grade., Gli FBS di grado USDA possono essere importati in qualsiasi paese privo di encefalopatia spongiforme bovina e afta epizootica, mentre gli FBS di grado europeo possono essere venduti nella maggior parte dei paesi europei e asiatici.
FBS è meglio conservato congelato, tra -5 e -20°C, e può essere scongelato ad una temperatura compresa tra 2 e 8°C. È spesso utile per aliquota e congelare il siero in porzioni più piccole, spesso 50 ml tubi, per evitare molti cicli di congelamento e disgelo. Occasionalmente, alcune aliquote di FBS rimangono in un liquido a temperature di congelamento., Ciò è dovuto alla mancanza di un centro di nucleazione (particolato) per la cristallizzazione (congelamento) per iniziare. Se semplicemente colpisci i tubi con il dito, di solito si solidificano quasi istantaneamente.
È comune avere qualche precipitato dopo lo scongelamento. I precipitati, probabilmente dovuti alla denaturazione di alcune proteine del siero, possono essere eliminati mediante una breve centrifugazione, e questo generalmente non influisce sulla qualità del siero.
Molti fornitori forniscono FBS con diversi gradi, paese di origine e trattamento., FBS, di per sé, è una miscela complessa e la variabilità tra diversi gradi, fornitori e lotti è prevedibile. Pertanto, è essenziale stabilire un processo per selezionare e valutare FBS. È una buona idea esaminare la letteratura per determinare come una particolare selezione di FBS è stata precedentemente utilizzata in ricerche simili o per la stessa coltura cellulare e prestare molta attenzione alla potenziale variazione lotto-lotto nell’FBS. Per aiutare con questo, Labome ha condotto un sondaggio di utilizzo FBS da pubblicazioni scientifiche, discusso di seguito, per aiutare i nostri visitatori a selezionare il più adatto FBS.,
Labome esamina la letteratura per i materiali utilizzati. Qui vengono riassunte le pubblicazioni che citavano il siero bovino fetale. Le pubblicazioni sono un sottoinsieme casuale di oltre 10.000 pubblicazioni.
I principali fornitori di FBS sono Life Technologies (ora parte di Thermo Fisher Scientific), Thermo Fisher Scientific Hyclone (ora parte di GE LifeScience) e MilliporeSigma (Tabella 2).
Life Technologies è una società globale di biotecnologie con sede a Carlsbad, California., Si è formata nel 2008 con la fusione di Invitrogen Corporation e Applied Biosystems Inc. Molti dei loro prodotti sono sotto il marchio Gibco. Forniscono prodotti di coltura cellulare, come il terreno di coltura cellulare, FBS e altri reagenti pertinenti. La società si è fusa con Thermo Fisher Scientific nel 2014.
FBS di Life Technologies è stato utilizzato per studiare il nucleolo come entità di controllo della qualità delle proteine separate da fase nelle cellule HEK293T e HeLa ., Pandolfini L et al hanno coltivato le cellule HEK293T e A549 in DMEM integrate con il 10% di Gibco FBS (10270-106) e le cellule Caco-2 nel mezzo essenziale minimo di Eagle integrate con il 20% di Gibco FBS (10270-106) . Le cellule HEK293T sono spesso mantenute con siero bovino fetale al 10% di Thermo Fisher .
GE Healthcare Hyclone FBS è ampiamente utilizzato. De Cecco M et al lo hanno usato al 15% per mantenere i fibroblasti senescenti LF1, IMR-90 e WI-38 nei media F-10 di Ham ., Nicetto D et al hanno usato Hyclone FBS (SH30071) per terminare la digestione della tripsina e mantenere le cellule embrionali . Laflamme C et al hanno mantenuto le cellule HEK-293 in DMEM ad alto glucosio da GE Healthcare (SH30081.01) contenente il 10% di siero di vitello bovino da GE Healthcare (SH30072.03) .
Frohner IE et al hanno mantenuto cellule Neuro-2a (N2a) e Cos-7 provenienti dalla raccolta di colture di tipo americano in DMEM contenenti 10% FBS di Bovogen, Francia . Laflamme C et al ha coltivato cellule U2OS in DMEM ad alto glucosio contenente il 10% di siero bovino fetale privo di tetraciclina di Wisent (081150) . Dong JX et al hanno mantenuto colture ippocampali primarie su Matrigel di Corning con siero bovino fetale al 5% di Atlanta Biologicals (S11550) ., Lee A et al ha coltivato mioblasti murini C2C12 con DMEM integrato con siero bovino fetale 10% da VWR (89510-186). Zhao N et al ha coltivato cellule U2OS da ATCC (HTB-96) in mezzo DMEM con siero bovino fetale al 10% (v/v) da Altas Biologicals . Liu X et al hanno coltivato le cellule murine 4T1 in DMEMsupplemented con siero bovino fetale di 10% da Biochrom .