Definizione: cosa sono i plasmidi?
Essenzialmente, i plasmidi sono piccole molecole circolari di DNA che sono in grado di replicarsi indipendentemente. In quanto tali, non si basano sul DNA cromosomico dell’organismo per la replicazione. A causa di questa caratteristica, sono anche indicati come DNA extra-cromosomico.,
Sebbene la molecola sia stata scoperta per la prima volta in un membro degli Enterobacteriacae, gli studi hanno dimostrato che i plasmidi si trovano naturalmente in molti tipi di microrganismi in tutto il mondo.,
* anche se ci sono stati dibattiti sul fatto che i plasmidi possono essere considerati come microrganismi, almeno con la proposta di definizione dei virus, vale la pena notare che il termine “plasmide” è in gran parte utilizzato per fare riferimento a elementi genetici che esistono al di fuori del cromosoma (nel DNA dell’organismo) e sono in grado di replicare in modo indipendente.,
Plasmids can be found in:
- Bacteria
- Archaea
- Various eukaryotes (yeast and plants)
Structure
With regards to structure, plasmids are made up of circular double chains of DNA., La struttura circolare dei plasmidi è resa possibile dalle due estremità dei doppi fili uniti da legami covalenti. Le molecole sono anche di piccole dimensioni, specialmente se confrontate con il DNA degli organismi, e misurano tra pochi kilobasi e diverse centinaia di kilobasi.
Sebbene un buon numero di plasmidi abbia una struttura circolare covalentemente chiusa, alcuni plasmidi hanno una struttura lineare e non formano una forma circolare.,
Generalmente, i plasmidi sono composti da tre componenti principali che includono:
Origine della replica (replicon) – L’origine della replica (ori) si riferisce a una posizione specifica nel filamento in cui la replica inizia. Per i plasmidi, questa posizione è in gran parte composta da coppie di basi A-T che sono più facili da separare durante la replicazione.,
Rispetto al DNA degli organismi che consiste in molte origini di replicazione, i plasmidi hanno una delle poche origini di replicazione perché sono di dimensioni più piccole. All’origine della replicazione, i plasmidi contengono anche una serie di elementi regolatori che contribuiscono al processo (ad esempio proteine Rep)
Polilinker (siti di clonazione multipla) – Nel plasmide, il polilinker (MCS) è una delle parti più importanti della molecola. Questo perché permette agli studenti di saperne di più sulla clonazione., Fondamentalmente, un polylinker è una breve sequenza di DNA costituito da alcuni siti per la scissione da enzimi di restrizione.
In quanto tale, MCS consente un facile inserimento del DNA attraverso la legatura o la digestione degli enzimi di restrizione. Nel sito di scissione, diversi polilinkers possono tagliare il filo. Pertanto, uno degli enzimi di restrizione può tagliare il plasmide in determinati punti del sire per consentire l’inserimento del DNA.
Gene di resistenza agli antibiotici-Il gene di resistenza agli antibiotici è uno dei componenti principali dei plasmidi., Questi geni svolgono un ruolo importante nella resistenza ai farmaci (a uno o più antibiotici) rendendo così il trattamento di alcune malattie più impegnativo.
I plasmidi sono oggi noti per la loro capacità di trasferire da una specie di batteri ad un’altra attraverso un processo noto come coniugazione (contatto tra cellule che è seguito dal trasferimento del contenuto di DNA). Nel processo, sono in grado di conferire proprietà di resistenza agli antibiotici ad altre specie di batteri.,
* Mentre la replicazione plasmidica fornisce un ulteriore vantaggio ai batteri (resistenza a determinati antibiotici), influisce anche sulla divisione cellulare dei batteri a causa del carico aggiuntivo di replicazione. Di conseguenza, i batteri con plasmidi tendono ad essere fuori popolati da quelli senza plasmidi a causa della ridotta divisione cellulare.,
Alcuni degli altri componenti di plasmidi sono:
Una regione del promotore – è la componente di plasmidi che è coinvolto nel reclutamento di macchinario trascrizionale.
Primer binding site – Si tratta di una breve sequenza di DNA su un singolo filamento che viene tipicamente utilizzato ai fini dell’amplificazione PCR o del sequenziamento del DNA.,
Sebbene i plasmidi condividano varie caratteristiche generali, esistono diversi tipi.
Funzioni e Tipi di Plasmidi
indicato Anche come resistenza antimicrobica plasmidi, plasmidi di resistenza sono un tipo di plasmidi che portano geni che svolgono un ruolo importante nella resistenza agli antibiotici. Sono anche altamente coinvolti nella coniugazione batterica producendo pili di coniugazione che trasferiscono il plasmide R da un batterio all’altro.,
I plasmidi di resistenza sono divisi in due gruppi principali che includono:
Gruppo Narrow-host-range – Spesso replicato all’interno di una singola specie.
Gruppo ad ampio raggio ospite-Facilmente trasferibile tra specie di batteri. Questo gruppo di plasmidi di resistenza ha dimostrato di portare una serie di geni di resistenza agli antibiotici., In seguito al trasferimento di geni di resistenza agli antibiotici a batteri sensibili ai farmaci, ciò può causare ai batteri di sviluppare resistenza verso una varietà di farmaci.
Plasmidi degradativi
Rispetto ad altri tipi di plasmidi, i plasmidi degradanti consentono all’organismo ospite di degradare / abbattere i composti xenobiotici., Indicati anche come sostanze recalcitranti, i composti xenobiotici includono una gamma di composti rilasciati nell’ambiente a seguito di azioni umane e quindi non sono presenti in natura o comuni in natura.
Gli ospiti di plasmidi degradativi si trovano nei gruppi IncP-1, IncP-7 e IncP-9 e includono specie come Ochrobactrum anthropi, Rhizobium sp, Burkholderia hospita, Escherichia coli e Pseudomonas fluorescens tra molti altri.,
A causa della capacità dell’ospite di degradare i composti xenobiotici, i ricercatori hanno tentato di utilizzare i plasmidi per degradare varie sostanze contaminanti nell’ambiente. Tuttavia, dato che questo non si è dimostrato efficace, gli studi di ricerca continuano ad essere condotti per determinare come utilizzare vari batteri indigeni (come ospiti di plasmidi degradativi) per la degradazione di tali composti.,
Mentre i plasmidi degradanti contribuiscono alla degradazione dei composti xenobiotici, il loro comportamento varia a seconda di una serie di fattori come la capacità di replicazione e stabilità. Ad esempio, i plasmidi trovati nel gruppo IncP-1 non solo hanno dimostrato di avere un’ampia gamma di host, ma anche un’alta frequenza di trasferimento.
Le differenze nel comportamento di diversi plasmidi degradativi hanno quindi dimostrato di provocare comportamenti diversi tra loro e i rispettivi ospiti.,
* L’uso di microrganismi biodegradativi allo scopo di rimuovere composti xenobiotici da ambienti contaminati è noto come Bioaugmentation.
* Mentre i plasmidi IncP-1 hanno una vasta gamma di host, IncP-7 ha dimostrato di avere una gamma di host ristretta. Inoltre, IncP-9 ha un intervallo host intermedio.,
Fertility Plasmids
Like many other plasmids, fertility plasmids (F plasmid) have a circular structure and measures about 100 kb.,>
Alcune delle principali parti del plasmide F includono:
- elemento Trasponibile (IS2, 1S3, e Tn1000)
- Replica siti (RepFIA, RepFIB, e RepFIC)
- Origine di trasferimento coniugativi (oirT)
- Replica regioni di origine
F plasmide gioca un ruolo importante nella riproduzione dato che contengono i geni che codificano per la produzione di sesso pilus così come gli enzimi necessari per la coniugazione., F plasmide contiene anche geni che sono coinvolti nel loro trasferimento. Pertanto, durante la coniugazione, migliorano il proprio trasferimento da una cellula all’altra.
Mentre le cellule che elaborano i plasmidi F sono indicate come donatori, quelle che mancano di questo fattore sono i riceventi. D’altra parte, i plasmidi che migliorano la capacità della cellula ospite di comportarsi come un donatore sono noti come fattore di trasferimento.,
Durante la coniugazione, la cellula donatrice (batteri) con pili di sesso (1-3 pili di sesso) si lega a una proteina specifica sulla membrana esterna del ricevente avviando così il processo di accoppiamento.
Dopo il binding iniziale, il pili si ritrae consentendo così alle due celle di legarsi insieme. Questo è poi seguito dal trasferimento del DNA dal donatore al ricevente e di conseguenza il trasferimento del plasmide F. Di conseguenza, il destinatario acquisisce il fattore F e acquisisce la capacità di produrre pilus sessuali coinvolti nella coniugazione.,
* Durante la coniugazione, solo il DNA viene passato dal donatore al ricevente. Pertanto, il citoplasma e altro materiale cellulare non vengono trasferiti.
* I pili sessuali sono minuscole strutture simili a bastoncelli che consentono alle cellule batteriche F-positive (cellule che hanno il fattore F) di attaccarsi alle F-negative (cellule prive del pili) femminili per promuovere il trasferimento coniugativo.,
Plasmidi Col
I plasmidi Col conferiscono ai batteri la capacità di produrre proteine tossiche note come colicine. Batteri come E. coli, Shigella e Salmonella usano queste tossine per uccidere altri batteri e quindi prosperare nei loro rispettivi ambienti.
Esistono diversi tipi di plasmidi Col che producono diversi tipi di colicine/colicine. Alcuni esempi di plasmidi Col includono Col B, Col E2 ed E3., Le loro differenze sono anche caratterizzate da differenze nel loro modo di agire.
Ad esempio, mentre Col B provoca danni alla membrana cellulare di altri batteri (privi del plasmide) Col E3 ha dimostrato di indurre la degradazione degli acidi nucleici delle cellule bersaglio.
Come i plasmidi della fertilità, alcuni dei plasmidi Col hanno dimostrato di trasportare elementi che migliorano la loro trasmissione da una cellula all’altra., Pertanto, attraverso la coniugazione o il processo di accoppiamento, in particolare per le cellule con il fattore F (plasmidi della fertilità), i plasmidi Col possono essere trasferiti da una cellula (donatrice) a un’altra (ricevente).
Di conseguenza, il ricevente acquisisce la capacità di produrre tossine che uccidono o inibiscono la crescita dei batteri bersaglio privi del plasmide.
* Le colicine / colicine appartengono a un gruppo di tossine note come batteriocine.,
* Queste tossine influenzano i batteri bersaglio influenzando processi come la replicazione del DNA, la traduzione e il metabolismo energetico tra gli altri.
Plasmidi di virulenza
Rispetto ad altri batteri innocui, i batteri che tendono ad essere patogeni in natura trasportano geni per fattori di virulenza che consentono loro di invadere e infettare i rispettivi ospiti.,
Per alcuni di questi batteri, i fattori di virulenza sono il risultato del materiale genetico degli organismi. Tuttavia, per altri, questo è il risultato di elementi genetici dal DNA extra-cromosomico. Anche se ci sono altre fonti di tali elementi, ad esempio trasposoni, plasmidi sono alcuni degli elementi genetici mobili più comuni.
Per quanto riguarda la patogenicità, i plasmidi di virulenza svolgono un ruolo importante dato che possono aiutare i batteri ad adattarsi efficacemente ai loro rispettivi ambienti., Questo perché il plasmide di virulenza può consentire all’organismo di esprimere una serie di funzioni associate alla virulenza fornendo così all’organismo caratteristiche più vantaggiose per prosperare nel loro ambiente.
Come altri tipi di plasmidi, i plasmidi di virulenza possono anche essere trasmessi da un batterio all’altro. Oltre al gene della virulenza, i plasmidi hanno anche dimostrato di trasportare altri elementi importanti che migliorano la trasmissione e il mantenimento.
Per questo motivo, sono di dimensioni maggiori ma con numeri bassi., Ciò assicura che non causino un onere aggiuntivo per l’organismo durante la divisione cellulare.
In genere, la divisione cellulare e la manutenzione delle cellule richiedono l’uso di energia. Avendo un basso numero di plasmidi di virulenza, alle cellule viene risparmiato un carico metabolico significativo che sarebbe necessario per la manutenzione e la duplicazione del genoma di numerosi plasmidi.,batteri per motivi di studio
Plasmide Vettore
Un vettore si riferisce a qualsiasi pezzo di molecola che contiene il materiale genetico che può essere replicato e ha espresso, quando viene trasferito in un’altra cella., Sulla base di questa definizione, è possibile capire perché le parole “vettore” e “plasmidi” sono talvolta scambiate. Tuttavia, questo non vuol dire che tutti i plasmidi siano vettori.
Una delle caratteristiche primarie dei vettori plasmidi è che sono di piccole dimensioni. Oltre alle loro dimensioni, sono caratterizzati da un’origine di replicazione, un marker selettivo e più siti di clonazione.
I vettori plasmidi ideali hanno numeri di copia elevati all’interno della cella. Come tale, assicura un numero elevato del gene bersaglio per scopi di clonazione., Ciò assicura anche che il gene di interesse sia aumentato durante la divisione genomica. Inoltre, il plasmide può avere un gene marcatore come marcatore visivo per aiutare a determinare se la clonazione ha avuto successo.
A causa dei loro molteplici siti di clonazione, i plasmidi hanno dimostrato di essere alcuni dei migliori vettori per la clonazione. A causa di questa caratteristica, è possibile che gli enzimi di restrizione scindano varie regioni del plasmide per la clonazione.,
Nel corso degli anni, l’utilizzo di questi vettori ha permesso di introdurre il DNA ricombinante nelle cellule ospiti a scopo di studio. Ad esempio, attraverso questo tipo di clonazione, è diventato possibile per i ricercatori sequenziare il genoma di una serie di specie, studiare l’espressione dei geni e persino osservare vari meccanismi cellulari.
* Mentre plasmidi più piccoli sono in grado di trasportare lunghi segmenti di DNA, dimensioni ridotte possono anche aiutare a rimuovere i geni non essenziali che non sono necessari per la clonazione.,
Isolamento plasmidico
Per ottenere DNA plasmidico purificato per procedure quali clonazione, PCR e trasfezione, è necessario eseguire l’isolamento plasmidico. Il processo prevede l’utilizzo di una serie di tecniche per ottenere il DNA plasmidico dalle cellule ospiti al fine di utilizzarlo in biologia molecolare.,
L’isolamento plasmidico comporta i seguenti passaggi:
Crescita cellulare (crescita di cellule batteriche) – Ciò comporta la crescita dei batteri che contengono plasmidi in una specifica coltura scossa. Qui, dato antibiotici possono essere utilizzati per prevenire la crescita di altri batteri indesiderati.
Centrifugazione – La crescita batterica è seguita dalla centrifugazione per pellet le cellule., Una volta che il surnatante è stato rimosso, può iniziare l’isolamento dei plasmidi.
Una delle tecniche più comuni per l’isolamento è il metodo classico che viene talvolta indicato come lisi alcalina.,ded in una soluzione isotonica (etilene diammina tetra acetato) che impedisce attività della nucleasi
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Biljana Miljkovic-Selimovic et al., (2007). Bacterial Plasmids. Naoto Ogawa, Ananda M.
Chakrabarty and Olga Zaborina. (2004). Chapter 16 : Degradative Plasmids.
Luis A. Actis, Marcelo E. Tolmasky, and Jorge H. Crosa. (1999). Bacterial Plasmids: Replication of Extrachromosomal Genetic Elements Encoding Resistance to Antimicrobial Compounds.