16S ribosom-RNA

16S rRNA-genet brukes for fylogenetisk studier som det er svært bevart mellom ulike arter av bakterier og archaea. Carl Woese (1977) tok initiativet til dette bruk av 16S rRNA. Det er foreslått at 16S rRNA-genet kan brukes som en pålitelig molekylær klokke fordi 16S rRNA-sekvenser fra distantly i slekt bakteriell linjene er vist å ha tilsvarende funksjonalitet. Noen thermophilic archaea (f.eks. for Thermoproteales) inneholder 16S rRNA-genet introns som er plassert i svært konserverte regioner og kan påvirke avspenning av «universal» primere., Mitokondrie og chloroplastic rRNA er også forsterket.

Den mest vanlige primerpar ble utviklet av Weisburg et al. (1991), og er i dag referert til som 27F og 1492R, men for enkelte programmer kortere amplikoner kan være nødvendig, for eksempel for 454-sekvensering med titanium kjemi primeren par 27F-534R som dekker V1 til V3.Ofte 8F er brukt i stedet for 27F. De to primerne er nesten identiske, men 27F har en M i stedet for en C. AGAGTTTGATCMTGGCTCAG sammenlignet med 8F.,

PCR and NGS applicationsEdit

In addition to highly conserved primer binding sites, 16S rRNA gene sequences contain hypervariable regions that can provide species-specific signature sequences useful for identification of bacteria.,Som et resultat, 16S rRNA-genet sekvensering har blitt utbredt i medisinsk mikrobiologi som et raskt og billig alternativ til å fenotypiske metoder for bakteriell identifikasjon. Selv om det ble opprinnelig brukt til å identifisere bakterier, sekvensering av 16S ble senere funnet å være i stand til reclassifying bakterier inn i helt nye arter, eller arter.Det har også blitt brukt for å beskrive nye arter som aldri har blitt kultivert.,Med tredje generasjons sekvensering kommer til mange labs, samtidig identifisering av tusenvis av 16S rRNA-sekvenser er mulig i løpet av timer, slik at metagenomic studier, for eksempel av tarmfloraen.

Hypervariable regionsEdit

Det bakterielle 16S genet inneholder ni hypervariable regioner (V1–V9), som spenner fra om lag 30 til 100 base-par lange, som er involvert i sekundær struktur av små ribosom subunit., Graden av bevaring varierer mellom hypervariable regioner, med mer konserverte regioner sammenstille til høyere nivå taksonomi og mindre konserverte regioner til lavere nivåer, for eksempel slekt og art. Mens hele 16S sekvens gir mulighet for sammenligning av alle hypervariable regioner, på ca 1500 base par lang tid det kan være uoverkommelig dyrt for studier som søker å identifisere eller karakterisere ulike bakterielle samfunn., Disse studiene ofte utnytte Illumina-plattformen, som produserer leser priser på 50-brett og 12 000-brett billigere enn 454 pyrosequencing og Sanger-sekvensering, henholdsvis. Mens billigere og som åpner for dypere fellesskap dekning, Illumina-sekvensering bare produserer leser 75-250 base par lange (opp til 300 base par med Illumina MiSeq), og har no etablert protokoll for pålitelig montering av hele genet i samfunnet prøver. Full hypervariable regioner kan være satt sammen av et enkelt Illumina kjøre, imidlertid, noe som gjør dem ideelle mål for plattformen.,

Mens 16S hypervariable regioner kan variere dramatisk mellom bakterier, 16S gen som helhet opprettholder større lengde homogenitet enn de eukaryote motstykke (18S ribosom-RNA), noe som kan gjøre justeringer lettere. I tillegg, 16S-genet inneholder svært bevart sekvenser mellom hypervariable regioner, slik at utformingen av universal primere som kan sikkert produsere de samme delene av 16S sekvens på tvers av ulike taksa. Selv om ingen hypervariable region kan nøyaktig klassifisere alle bakterier fra domene til arter, noen kan sikkert forutsi bestemte taksonomisk nivå., Mange samfunn studier velge semi-bevart hypervariable regioner som V4 på grunn av dette, som det kan gi oppløsning på phylum nivå så nøyaktig som full 16S-genet. Mens mindre konserverte regioner sliter med å klassifisere nye arter når høyere for taksonomi er ukjent, de er ofte brukt til å detektere tilstedeværelsen av spesifikke patogener. I en studie av Chakravorty et al. i 2007, forfatterne preget V1–V8 regioner av en rekke patogener for å finne ut hvilken hypervariable regioner ville være mest nyttig å ha for sykdom-spesifikke og brede analyser., Blant andre funn, de bemerket at V3-regionen var best på å identifisere slekten for alle patogener testet, og at V6 var den mest nøyaktige på å skille arter mellom alle CDC-så patogener testet, inkludert anthrax.

Mens 16S hypervariable region analyse er et kraftig verktøy for bakteriell taksonomisk studier, det sliter med å skille mellom nært beslektede arter. I familier Enterobacteriaceae, Clostridiaceae, og Peptostreptococcaceae, arter kan dele opp til 99% sekvens likhet over hele 16S-genet., Som et resultat, V4-sekvenser kan variere fra bare et par nukleotider, forlater referanse databaser i stand til å pålitelig klassifisere disse bakteriene på lavere taksonomisk nivå. Ved å begrense 16S analyse for å velge hypervariable regioner, disse studiene kan mislykkes i å observere forskjeller i nært knyttet taksa og gruppere dem inn i ett taksonomisk enheter, derfor underslår det totale mangfoldet av prøven. Videre, bakterielle genomer kan huse flere 16S gener, med V1, V2, og V6 regioner som inneholder den største intraspecies mangfold., Selv ikke den mest presise metoden for å klassifisere bakteriearter, analyse av den hypervariable regioner er fortsatt en av de mest nyttige verktøyene som er tilgjengelige for bakteriell samfunnet studier.