Mikrobiologi (Norsk)

En mutasjon er en heritable endring i DNA-sekvensen til en organisme., Den resulterende organisme, som kalles en mutant, kan ha en gjenkjennelig endring i fenotypen i forhold til wild-type, som er fenotypen oftest observert i naturen. En endring i DNA-sekvensen er overdratt til mRNA gjennom transkripsjon, og kan føre til en endret aminosyre-sekvensen i et protein på oversettelsen. Fordi proteiner utfører de aller fleste av cellulære funksjoner, en endring i aminosyre-sekvensen i et protein kan føre til en endret fenotypen for celle-og organisme.,

Virkninger av Mutasjoner på DNA-Sekvens

Det finnes flere typer av mutasjoner som er klassifisert i henhold til hvordan DNA-molekylet er endret. Den ene typen, kalt et punkt mutasjon, påvirker en enkelt base og oppstår som oftest når en base byttes eller erstattes av en annen. Mutasjoner også være et resultat av tillegg av ett eller flere baser, som er kjent som en innsetting eller fjerning av en eller flere baser, kjent som en sletting.

Virkninger av Mutasjoner på Protein Struktur og Funksjon

Punkt mutasjoner kan ha en rekke virkninger på protein funksjon (Figur 1). Som en konsekvens av degenererthet av den genetiske koden, et punkt mutasjon vil ofte resultere i den samme aminosyre blir innlemmet i den resulterende polypeptid på tross av den sekvensen du vil endre. Denne endringen vil ikke ha noen effekt på protein s struktur, og er derfor kalt en stille mutasjon. En missense mutasjon resultater i en annen aminosyre blir innlemmet i den resulterende polypeptid., Effekten av en missense mutasjon avhenger av hvor kjemisk forskjellige ny aminosyre er fra wild-type aminosyre. Plasseringen av endret aminosyre i proteinet er også viktig. For eksempel, hvis endret aminosyre er en del av enzymet er aktivt området, så effekten av missense mutasjon kan være betydelig. Mange missense mutasjoner resulterer i proteiner som fortsatt er funksjonell, i hvert fall til en viss grad. Noen ganger effekten av missense mutasjoner kan være bare tilsynelatende under visse miljøforhold, slik missense mutasjoner er kalt betinget mutasjoner., Sjelden, et missense mutasjon kan være gunstig. Under de rette forholdene, denne type mutasjon kan gi organismen som havner det en selektiv fordel. Ennå en annen type punkt mutasjon, som kalles en nonsense mutasjon, konverterer et codon koding en aminosyre (en følelse codon) til en stopp codon (en tull codon). Tull mutasjoner resulterer i syntese av proteiner som er kortere enn vill-type og vanligvis ikke i bruk.

Sletting og innsetting også gi ulike virkninger., Fordi codons er trillinger av nukleotider, innsetting eller sletting i grupper på tre nukleotider kan føre til innsetting eller sletting av en eller flere aminosyrer og kan ikke føre til betydelige effekter på den resulterende protein funksjonalitet. Imidlertid, frameshift mutasjoner, forårsaket ved innsetting eller sletting av en rekke nukleotider som ikke er et multiplum av tre er svært problematisk fordi en endring i lesing ramme resultater (Figur 1). Fordi ribosomes les mRNA i trilling codons, frameshift mutasjoner kan endre seg hver aminosyre etter punktet av mutasjon., Den nye lesing kan det hende at rammen inkluderer også en stopp codon før slutten av den kodende sekvensen. Følgelig, proteiner laget av gener som inneholder frameshift mutasjoner er nesten alltid formålsløse.

Figur 1. Klikk for større bilde. Mutasjoner kan føre til endringer i protein sekvens er kodet av DNA.

En Gunstig Mutasjon

Siden det første tilfellet av infeksjon med humant immunsviktvirus (HIV) som ble rapportert i 1981, nesten 40 millioner mennesker har dødd av HIV, viruset som forårsaker ervervet immunsvikt syndrom (AIDS)., Viruset mål hjelper T-celler som spiller en sentral rolle i å bygge bro mellom det medfødte og det adaptive immunforsvaret, infisere og drepe celler som normalt er involvert i kroppens svar på infeksjoner. Det er ingen kur for HIV-smitte, men mange stoffer har blitt utviklet for å redusere eller blokkere utviklingen av virus. Selv om enkeltpersoner over hele verden, kan bli infisert, den høyeste prevalensen blant folk 15-49 år er i Afrika sør for Sahara, der nesten en person i 20-en er infisert, sto for mer enn 70% av infeksjonene verden over (Figur 2)., Dessverre, dette er også en del av verden hvor forebyggende strategier og legemidler til behandling av infeksjon er den mest mangler.

Figur 2. HIV er utbredt i Afrika sør for Sahara, men dens utbredelse er ganske lav i enkelte andre deler av verden.

I de siste årene, vitenskapelig interesse har blitt pirret av oppdagelsen av et fåtall personer fra nord-Europa som er resistente mot HIV-smitte. I 1998, American genetiker Stephen J., O ‘ Brien ved National Institutes of Health (NIH) og kolleger publiserte resultatene av sin genetiske analyser av mer enn 4000 personer. Disse viste at mange individer av Asiatisk avstamning (opp til 14% i noen etniske grupper) har en sletting mutasjon, kalt CCR5-delta 32, i genkode CCR5. CCR5 er en coreceptor funnet på overflaten av T-celler som er nødvendig for mange stammer av viruset å angi verts-cellen. Mutasjonen fører til produksjon av en reseptor som HIV kan ikke effektivt å binde og dermed blokkerer viral oppføring., Folk homozygote for denne mutasjonen har sterkt redusert risiko for HIV-infeksjon, og de som er heterozygote har noen beskyttelse mot infeksjon i tillegg.

Det er ikke klart hvorfor mennesker av nord-Europeisk herkomst, spesielt, bærer denne mutasjonen, men dens utbredelse synes å være størst i nord-Europa, og stadig nedgang i bestander som man beveger seg sørover. Forskning viser at mutasjonen har vært til stede siden før HIV dukket opp, og kan ha blitt valgt i den Europeiske populasjoner som et resultat av eksponering til plage eller kopper., Denne mutasjonen kan beskytte individer fra pesten (forårsaket av bakterien Yersinia pestis) og kopper (forårsaket av variola virus) fordi denne reseptoren kan også være involvert i disse sykdommer. Alder av denne mutasjonen er en del av debatten, men anslag tyder på at det dukket opp mellom 1875 år til 225 år siden, og kan ha blitt spredt fra Nord-Europa gjennom Viking invasjoner.

Denne spennende å finne på, har ført til nye muligheter i HIV-forskning, inkludert jakt etter stoff til å blokkere CCR5 binding til HIV i personer som mangler mutasjon., Selv om DNA-testing for å finne ut hvilke individer som bærer CCR5-delta 32 mutasjonen er mulig, det er dokumentert tilfeller av personer homozygote for mutasjonen å pådra seg HIV. For denne grunn, DNA-testing for mutasjon er ikke mye som er anbefalt av offentlige helsemyndigheter, slik som å ikke oppmuntre til risikofylt atferd, i de som bærer mutasjonen. Likevel, å hemme bindingen av HIV til CCR5 fortsetter å være en gyldig strategi for utvikling av stoffet terapi for de som blir smittet med HIV.,

Årsakene til Mutasjoner

Feil i prosessen av DNA replikering kan forårsake spontane mutasjoner oppstår. Feilraten av DNA-polymerase er en feil base per milliard base par replikert. Eksponering for mutagens kan føre til induserte mutasjoner, som er ulike typer av kjemiske midler, eller stråling (Tabell 1). Eksponering for en mutagen kan øke frekvensen av mutasjon mer enn 1000-brett. Mutagens er ofte også kreftfremkallende stoffer, legemidler som kan forårsake kreft. Imidlertid, mens nesten alle kreftfremkallende stoffer er mutagene, ikke alle mutagens er nødvendigvis kreftfremkallende stoffer.,

Kjemisk Mutagens

Ulike typer kjemiske mutagens samhandle direkte med DNA-enten ved å opptre som nucleoside analogs eller ved å endre nukleotid baser., Kjemikalier kalles nucleoside analogs er strukturelt lik normal nukleotid baser og kan bli innarbeidet i DNA under replikasjon (Figur 3). Disse base analogs forårsake mutasjoner fordi de ofte har forskjellige base-sammenkobling regler enn baser de erstatter. Andre kjemiske mutagens kan endre normal DNA-baser, noe som resulterer i ulike base-sammenkobling regler. For eksempel, lystgass syre deaminates cytosine, konvertere den til uracil. Uracil deretter par med adenine i en påfølgende runde med replikering, noe som resulterer i konvertering av GC-base-par til en base blir VED et par., Lystgass acid også deaminates adenine å hypoxanthine, som base par med cytosine i stedet for innhold av tymin, noe som resulterer i konvertering av en TA utgangspunkt par til en CG base-par.

Figur 3. Klikk for større bilde. (a) 2-aminopurine nucleoside (2AP) strukturelt er en nucleoside analog til adenine nucleoside, mens 5-bromouracil (5BU) er en nucleoside analog til innhold av tymin nucleoside. 2AP base par med C, konvertere en base blir VED et par til en GC-base-par etter flere runder med replikering., 5BU par med G, konvertere en base blir VED et par til en GC-base-par etter flere runder med replikering. (b) Lystgass syre er en annen type kjemiske mutagen som endrer allerede eksisterende nucleoside baser som C for å produsere U, som base par med A. Dette kjemisk modifikasjon, som vist her, resultater i å konvertere en CG base par til a TA base-par.

Kjemisk mutagens kjent som intercalating agenter jobber annerledes., Disse molekylene skyv mellom stablet nitrogenholdige baser i DNA-dobbel helix, forvrenge molekyl og skape atypisk avstanden mellom nukleotid base-par (Figur 4). Som et resultat, under DNA replikasjon, DNA polymerase kan enten hoppe over kopiere flere nukleotider (opprette en sletting), eller sette inn ekstra nukleotider (opprette en innsetting). Enten utfallet kan føre til en frameshift mutasjon. Forbrenning produkter som polysykliske aromatiske hydrokarboner er spesielt farlig intercalating agenter som kan føre til mutasjon-forårsaket kreft., Den intercalating agenter etidiumbromid og acridine oransje er vanligvis brukes i laboratoriet til å flekken DNA for visualisering og er potensielle mutagens.

Figur 4. Intercalating agenter, for eksempel acridine, introdusere atypisk avstanden mellom base-par, noe som resulterer i DNA polymerase å innføre enten en sletting eller en innsetting, som fører til en potensiell frameshift mutasjon.

Stråling

Eksponering for enten ioniserende eller nonionizing radiation kan forårsake mutasjoner i DNA, selv om det av ulike mekanismer., Sterk ioniserende stråling som røntgen og gamma-stråler kan føre enkel – og dobbel-strandet brudd i DNA-ryggraden gjennom dannelsen av hydroksyl-radikaler på stråling (Figur 5). Ioniserende stråling kan også endre baser, for eksempel deamination av cytosine til uracil, analogt til virkningen av lystgass syre. Ioniserende stråling er brukt til å drepe mikrober til å sterilisere medisinsk utstyr og mat, på grunn av sin dramatiske uspesifikk effekt i å skade DNA, proteiner og andre cellulære komponenter (se Bruke Fysiske Metoder for å Kontrollere Mikroorganismer).,

Nonionizing radiation, som ultrafiolett lys, er ikke sprek nok til å starte disse typer kjemiske endringer. Imidlertid, nonionizing radiation kan indusere dimer dannelse mellom to tilstøtende pyrimidin baser, vanligvis to thymines, innen en nukleotid strand. I løpet av innhold av tymin dimer dannelse, to tilstøtende thymines bli kovalent bundet og, hvis venstre ureparert, både DNA replikasjon og transkripsjon er stoppet opp på dette punktet. DNA-polymerase kan gå videre og gjenskape dimer feil, potensielt fører til frameshift eller mutasjoner.,

Figur 5. (en) Ioniserende stråling kan føre til dannelse av enkelt-strandet og dobbel-strandet pauser i sukker-fosfat ryggraden i DNA, så vel som modifisering av baser (ikke vist). (b) Nonionizing radiation som ultrafiolett lys kan føre til dannelse av innhold av tymin dimers, som kan stall replikasjon og transkripsjon og introdusere frameshift eller mutasjoner.

DNA-Reparasjon

prosessen av DNA replikering er svært nøyaktig, men feil kan oppstå spontant eller være forårsaket av mutagens. Ukorrigerte feil kan føre til alvorlige konsekvenser for fenotypen. Cellene har utviklet flere reparasjon mekanismer for å redusere antall mutasjoner som vedvarer.,

Korrektur

de Fleste av feilene innført under DNA-replikasjon er raskt korrigert av de fleste DNA polymerases gjennom en funksjon kalt korrektur. I korrekturlesing, DNA polymerase leser nylig lagt til base, og sikre at den er komplementær til den korresponderende base i malen strand før du legger den neste. Hvis en feil base har blitt lagt til, enzym gjør et kutt for å frigjøre feil nukleotid, og en ny base er lagt til.,

Mismatch Repair

Noen feil introdusert i løpet replikering er korrigert kort tid etter replikering maskiner har flyttet på seg. Denne mekanismen kalles mismatch repair. Enzymer involvert i denne mekanismen gjenkjenne feilaktig lagt nukleotid, særavgifter det, og erstatte den med den riktige base. Et eksempel er methyl-anvist mismatch repair i E. coli. DNA er hemimethylated. Dette betyr at foreldrenes strand er denaturert mens den nylig syntetisert datter strand er det ikke. Det tar flere minutter før den nye strand er denaturert., Proteiner MutS, MutL, og MutH binder seg til hemimethylated stedet hvor feil nukleotid er funnet. MutH kutter nonmethylated strand (den nye strand). En exonuclease fjerner en del av strand (inkludert feil nukleotid). Gapet dannet er så fylt opp av DNA pol III og ligase.

Reparasjon av innhold av tymin Dimers

Fordi produksjonen av innhold av tymin dimers er vanlig (mange organismer ikke kan unngå ultrafiolett lys), mekanismer har utviklet seg til å reparere disse lesjonene., I nukleotid eksisjon reparasjon (også kalt mørk repair), enzymer fjerne pyrimidin dimer og erstatte den med den riktige nukleotider (Figur 6). I E. coli, DNA er skannet ved hjelp av et enzym komplekse. Hvis en forvrengning i dobbel helix er funnet som ble introdusert av pyrimidin dimer, den enzym komplekse kutt sukker-fosfat ryggraden flere baser oppstrøms og nedstrøms av dimer, og den delen av DNA mellom disse to kutt er så enzymatically fjernet. DNA pol jeg erstatter den manglende nukleotider med riktig kjære og DNA ligase sel gapet i sukker-fosfat ryggraden.,

Den direkte reparasjon (også kalt lys reparasjon) av innhold av tymin dimers oppstår gjennom prosessen med photoreactivation i nærvær av synlig lys. Et enzym kalt photolyase gjenkjenner forvrengning i DNA-spiral som skyldes innhold av tymin dimer og binder seg til dimer. Deretter, i nærvær av synlig lys, photolyase enzym endringer konformasjon og pauser fra hverandre innhold av tymin dimer, slik at den thymines til igjen på korrekt måte base par med adenines på komplementære strand., Photoreactivation ser ut til å være til stede i alle organismer, med unntak av placental pattedyr, inkludert mennesker. Photoreactivation er spesielt viktig for organismer kronisk utsettes for ultrafiolett stråling, som planter, fotosyntetiske bakterier, alger og koraller, for å hindre akkumulering av mutasjoner forårsaket av innhold av tymin dimer dannelse.

Figur 6. Klikk for større bilde. Bakterier har to mekanismer for reparasjon av innhold av tymin dimers., (en) I nukleotid eksisjon reparasjon, et enzym komplekse gjenkjenner forvrengning i DNA komplekse rundt innhold av tymin dimer og kutter og fjerner skadet DNA-strand. Riktig nukleotider er erstattet av DNA pol jeg og nukleotid strand er forseglet av DNA-ligase. (b) I photoreactivation, enzymet photolyase binder seg til innhold av tymin dimer, og i nærvær av synlig lys, pauser fra hverandre dimer, gjenopprette base sammenkobling av thymines med utfyllende adenines på motsatt DNA-strand.,

Identifisere Bakteriell Mutanter

En vanlig teknikk som brukes til å identifisere bakteriell mutanter er kalt replika plating., Denne teknikken er brukt til å oppdage ernæringsmessige mutanter, kalt auxotrophs, som har en mutasjon i et gen koding av et enzym i biosyntese veien til et bestemt næringsstoff, slik som en aminosyre. Som et resultat, mens wild-type celler beholde evnen til å vokse normalt på et medium som mangler spesifikke næringsstoffer, auxotrophs er ute av stand til å vokse på et slikt medium. Under replika plating (Figur 7), og en bestand av bakterielle celler er mutagenized og deretter belagt som individuelle celler på en kompleks ernæringsmessig komplett plate, og fikk lov til å vokse inn i koloniene., Celler fra disse koloniene er fjernet fra denne master-plate, ofte ved bruk av sterile fløyel. Dette fløyel, som inneholder celler, er så inne i den samme retningen på plater av ulike medier. Minst en plate bør også være ernæringsmessig komplett for å sikre at cellene blir riktig overført mellom platene. De andre platene mangel spesifikke næringsstoffer, slik at forskeren til å oppdage ulike auxotrophic mutanter i stand til å produsere spesifikke næringsstoffer. Celler fra samme koloni på den ernæringsmessig komplett plate kan brukes til å gjenopprette mutant for videre studier.,

Figur 7. Identifisering av auxotrophic mutanter, som histidin auxotrophs, er gjort ved hjelp av replika plating. Etter mutagenesis, kolonier som vokser på ernæringsmessig komplett medium, men ikke på middels mangler histidin er identifisert som histidin auxotrophs.

Ames-Test

Ames test, som er utviklet av Bruce Ames (1928–) på 1970-tallet, er en metode som bruker bakterier for rask, billig screening av kreftfremkallende potensial av nye kjemiske forbindelser. Testen måler mutasjon pris forbundet med eksponering til det sammensatte, som, hvis forhøyet, kan tyde på at eksponering for denne forbindelsen er forbundet med større risiko for lungekreft., Ames test bruker som test organismen en stamme av Salmonella typhimurium, som er en histidin auxotroph, ute av stand til å syntetisere sine egne histidin på grunn av en mutasjon i et viktig gen som er nødvendig for syntese. Etter eksponering for en potensiell mutagen, disse bakteriene er belagt på en middels mangler histidin, og antall mutanter å gjenvinne evnen til å syntetisere histidin er registrert og sammenlignet med antallet av slike mutanter som oppstår i fravær av potensielle mutagen (Figur 8)., Kjemikalier som er mer mutagene vil få flere mutanter med restaurert histidin syntese i Ames-test. Fordi mange kjemikalier er ikke direkte mutagene men metaboliseres til mutagene former av leverenzymer, rotte leveren ekstrakt er vanligvis inkludert i starten av dette eksperimentet for å etterligne levermetabolisme. Etter Ames-test er gjennomført, stoffer som er identifisert som mutagene er videre testet for deres potensielle kreftfremkallende egenskaper ved hjelp av andre modeller, inkludert dyr modeller som mus og rotter.

Figur 8., Ames test er brukt for å identifisere mutagene, potensielt kreftfremkallende kjemikalier. En Salmonella histidin auxotroph brukes som test belastning, utsatt for en potensiell mutagen/kreftfremkallende. Antall hjemfall mutanter i stand til å vokse i fravær av medfølgende histidin telles og sammenlignes med antall naturlige hjemfall mutanter som oppstår i fravær av potensielle mutagen.