Hva er RNA-seq?
RNA-seq (RNA-sekvensering) er en teknikk som kan undersøke mengden og sekvenser av RNA i en prøve med neste generasjons sekvensering (NGS). Det analyserer transcriptome av genuttrykk mønstre som er kodet i vår RNA. Her ser vi på hvorfor RNA-seq er nyttig, hvordan teknikken fungerer, og den grunnleggende protokollen som er ofte brukt today1.
Hva er programmer av RNA-seq?,
RNA-seq lar oss undersøke og oppdage transcriptome, totalt cellular innhold av RNAs inkludert mRNA, rRNA og tRNA. Forstå transcriptome er avgjørende hvis vi skal koble informasjon på våre genom med sin funksjonelle protein uttrykk. RNA-seq kan fortelle oss hvilke gener som er skrudd på, i en celle, hva er deres nivå av uttrykket er, og på hvilke tidspunkt de er aktivert eller stenge off2. Dette tillater forskere å mer dypt forstå biologien i en celle og vurdere endringer som kan indikere sykdom., Noen av de mest populære teknikker som bruker RNA-seq er transcriptional profilering, SNP identifikasjon, RNA-redigering og differensiert genuttrykk analysis3.
Dette kan gi forskerne viktig informasjon om funksjonen til gener. For eksempel, den transcriptome kan markere alle vev der et gen av ukjent funksjon er uttrykt, noe som kan tyde på hva dens rolle er. Den fanger også informasjon om alternativ spleising hendelser (Figur 1), som produserer ulike transkripsjonene fra ett enkelt gen rekkefølge. Disse hendelsene ikke ville bli plukket opp av DNA-sekvensering., Det kan også identifisere post-transcriptional endringer som oppstår i løpet av mRNA behandling som polyadenylation og 5′ capping2.
Figur 1: RNA-seq data bruker bruker kort leser av mRNA som er fri for intronic ikke-kodende DNA. Disse leser må da justeres tilbake til referanse-genom.
Hvordan gjør RNA-seq arbeid?
Tidlig RNA-seq teknikker som brukes Sanger-sekvensering teknologi, en teknikk som gjør at selv om nyskapende på den tiden, var også lav gjennomstrømning, kostbare, og unøyaktig., Det er bare nylig, med bruk og spredning av NGS-teknologi, har vi vært i stand til å fullt ut dra nytte av RNA-seq ‘ s potential4.
Det første trinnet i den teknikk som innebærer konvertering av befolkningen av RNA til å bli sekvensert i cDNA fragment (et cDNA-bibliotek). Dette gjør at RNA å bli satt inn i en NGS arbeidsflyt. Adaptere er deretter lagt til i hver ende av fragmenter. Disse kortene inneholder funksjonelle elementer som tillater sekvensering, for eksempel forsterkning element og den primære sekvensering nettstedet., Den cDNA bibliotek er deretter analysert ved NGS, produsere korte sekvenser som svarer til enten en eller begge endene av fragment. Dybden der biblioteket er sekvensert varierer avhengig av teknikker som output data vil bli brukt til. Den sekvensering ofte følger med enten enkel-lese eller sammenkoblet-end-sekvensering metoder. Single-les-sekvensering er en billigere og raskere teknikk (for referanse, om lag 1% av kostnaden av Sanger-sekvensering) som sekvenser av cDNA fra bare den ene enden, mens sammenkoblede-end metoder sekvens fra begge ender, og er derfor dyrere og mer tid-consuming5,6.,
En ytterligere valg må gjøres mellom strand-spesifikk og ikke-strand-spesifikke protokoller. Den tidligere metoden betyr at informasjon om hvilke DNA-strand ble transkribert er beholdt. Verdien av ekstra informasjon som er innhentet fra strand-spesifikke protokoller gjør dem til gunstig alternativ.
Disse leser, som det vil være mange millioner ved utgangen av arbeidsflyten, og kan da justeres til et genom av referanse-og satt sammen for å produsere en RNA-sekvens kart som spenner over transcriptome7.,
RNA-seq vs microarrays: Hvorfor RNA-seq er betraktet som overlegen
RNA-seq er ansett som bedre enn andre teknologier, slik som microarray hybridisering. Det er flere grunner til RNA-seq er vel ansett status
En RNA-seq protocolExperiment Planlegging
Forberedelse før du starter ditt RNA-seq eksperimentet er viktig. Spørsmål å svare på før du starter include10:
•Hvilken metode av RNA-rensing er det du bruker?
•Hvor mange leser du trenger?
•Hvilken plattform vil du bruke?,
•Hva referanse genom vil du bruke?
•Hvordan er du vurdere kvaliteten på din RNA?
•trenger du å forbedre dine mål RNA?
•Vil du strekkode din RNA?
•Har jeg fått nok biologisk og teknisk replikater?
•Single-lese eller sammenkoblet-end-sekvensering?
cDNA Bibliotek Forberedelse
Etter disse punktene har vært vurdert, kan du begynne å forberede din cDNA bibliotek. Dette vil kreve å legge plattform-spesifikke «- adapter sekvenser» og amplifikasjon av DNA, men den nøyaktige prosedyren vil være svært spesifikke til plattformen som brukes på dette stadiet., Amplifikasjon av DNA innebærer et revers transkriptase-mediert første strand syntese etterfulgt av en DNA-polymerase-mediert andre strand synthesis10,11.
cDNA-Sekvensering
Når biblioteket er forberedt, og adaptere som er lagt til, kan du bruke din valgte sekvensering plattform for å sekvensen din cDNA-bibliotek til ønsket dybde. Når transkripsjonen data har blitt produsert, og du kan tilordne dataene til din referanse genom., Justeringen kan være komplisert av tilstedeværelsen av splice-varianter og tilpasninger, og valg av referanse genom som er brukt vil også variere hvor vanskelig dette stadiet. Programvarepakkene som STAR er nyttig i denne fasen, som er kvalitetskontroll verktøy som Picard eller Qualimap12.
RNA-Seq Data Analyse
Etter justering scenen, du kan fokusere på å analysere dataene. Verktøy som Sailfish, RSEM og BitSeq12 vil hjelpe deg å kvantifisere uttrykket nivåer, mens verktøy som MISO, som kvantifiserer alternativt kan skjøtes gener, er tilgjengelig for mer spesialisert analysis13., Det er et bibliotek av disse verktøyene som finnes der ute, og å lese anmeldelser og oversikter er din beste måten å finne riktig verktøy for din forskning.
for Å oppsummere, moderne-dag RNA-seq er godt etablert som superior muligheten til å microarrays, og vil trolig fortsatt være den foretrukne alternativet for tiden.
5.https://systemsbiology.columbia.edu/genome-sequencing-defining-your-experiment
6.https://emea.illumina.com/science/technology/next-generation-sequencing/paired-end-vs-single-read-sequencing.html
9.https://cofactorgenomics.com/advantages-rna-seq-over-microarray-technology/
10.http://bioinformatics.ucdavis.edu/docs/2015-june-workshop/_downloads/Th_MB_RNASeq_Intro.pdf
11.https://rnaseq.uoregon.edu/#library-prep-stranded-libraries