Dyr
Alle eksperimenter ble utført ved bruk av ikke-oppdretter mannlige og kvinnelige C57/B6 mus (2-3 måneder). Hvert kjønn bidratt til omtrent halvparten av det totale antall dyr i hvert eksperiment. Dyrene ble plassert i en 12/12 h mørk/lys syklus og hadde ubegrenset tilgang til mat og vann., Bruk av mus i disse eksperimentene var i samsvar med Veiledning for Stell og Bruk av forsøksdyr og eksperimentelle protokoller ble godkjent av Universitetet i Sør-California Institutional Animal Care and Use Komité (IACUC).
Lys eksponering
Øyne var dilatert med 0,5% Tropicamide Oftalmiske Løsning USP (AKORN) og 2,5% Phenylephrine Hydrochloride Oftalmiske Løsning USP (AKORN). Musene var mørk-tilpasset over natten., De ble holdt i mørke eller utsatt for en diffus kjølig hvitt fluorescerende lys på verdien nivå av 5000 lux for 30 min 1 t før de blir euthanized. Mørk-tilpasset prøver for begge metodene ble utarbeidet i et mørkerom under infrarødt lys og alle prosedyrer som involverer mørk-tilpasset vev ble utført ved hjelp av en dissekerende mikroskop utstyrt med infrarød omformere (B. E. Meyers & Co, Inc.). Lys utsatt prøver ble behandlet under en dissekerende omfang i rommet lys.,
Retina-disseksjon
Mus ble euthanized av isofluran innånding etterfulgt av livmorhalskreft forvridning. Øynene var avkjernet og retinas ble isolert i en 35 x 10 mm petriskål som er fylt med riktig buffer/løsningen som er beskrevet nedenfor. Hornhinnen, linsen, og glasserte humor ble fjernet fra hvert øye og retinal pigmentert epitel (RPE) og sclera var nøye plukket bort fra hver netthinnen. Den isolerte retinas var hemisected med en fjær skalpell i en 60 × 15 mm rett og kantene var trimmet til å skape to rektangler., Minimere krumning av hver halvert retina-assistert i utflating av netthinnen, og sørget for en nøyaktig skrelle av retinal lag. Riktig beskjæring av folding kantene av netthinnen er viktig: dersom retina har brette kantene når den plasseres på filterpapir, vil det resultere i en redusert avkastning av isolert ROS og enda viktigere vil være forurenset med andre retinal lag.
Immunocytokjemi
Før enucleation, superior-polet av hornhinnen var preget av cauterization og hornhinnen, linsen, og glasserte ble senere fjernet., De resterende øye kopper ble plassert i 4% paraformaldehyde i PBS i 15 min og skylles 3 ganger i 10 min i PBS. Øyet kopper var cryoprotected i 30% sukrose i PBS for 2 h, plassert i Vev-Teck® O. C. T. sammensatte (Sakura Finetek, USA) og raskt frosset i flytende N2. Den frosne blokker ble delt på 10 µm i en kryostat (CM 3050 S, Leica Microsystems) og lagret i -80 °C. Før antistoff inkubasjon, ble de delene likevekt til romtemperatur (RT) i 15 min., For GNAT1 farging med TF-15 musen monoklonalt antistoff, epitope henting ble utført: seksjonene ble behandlet i 2 min RT med 0,02 mg/ml proteinase K i blokkere buffer (2% bovine serum albumin, 2% geit serum, 0.3% Triton X-100 i 1X PBS) og oppvarmet til 65 °C i 10 s etterfulgt av fem skyllinger med PBS. Blokkere buffer ble deretter brukt til alle seksjoner for 1 h. Seksjonene var enten inkubert med kaninen antistoff mot ARR1 (C10C10 fortynnet 1:100 i blokkere buffer) eller TF-15 (CytoSignal, fortynnet 1:200 i blokkere buffer)., Delene ble skylt og inkubert med fluorescein-merket sekundært antistoff (Vector Laboratories). Alle delene var dobbeltklikk farget med biotinylert antistoff mot rhodopsin (1D4 fortynnet 1:300 i blokkere buffer). Delene ble skylt og inkubert med rhodamine Avidin D (1:100, Vektor Laboratories). Bildene ble innhentet ved hjelp av en Zeiss AxioPlan2 mikroskop. Lys og mørke forhold ble fotografert ved hjelp av identiske eksponering.,
ROS samling av sekvensiell peeling med filterpapir
filter papir peeling metode ble tilpasset fra en teknikk for å utsette fluorescentmerkede merket bipolare celler i en retinal flatskjerm mount for patch-clamp-innspillinger . Peeling bort photoreceptor celle er flere lag med filter papir gradvis avslører bipolar celle dendrites og cellen organer for enklere tilgang for elektrisk stimulering og patch-clamp-målinger. Vi fant at de skrelte biprodukter, den photoreceptor lag som er fast på filterpapir, var mottagelig for påfølgende Western blot analyser.,
Ames’ medium ble brukt for manipulering av live retinal vev (Sigma-Aldrich A1420). To ulike buffere var forberedt: Ames’-HEPES (til 1 L legge til 2.38 g HEPES, 0.877 g NaCl, pH 7.4) og Ames’-bikarbonat (til 1 L legge til 1,9 g NaHCO3, pH 7.4). Begge var forberedt på forhånd, steril filtrert, og lagret ved 4 °C. Alle prosedyrer ble utført på RT., Før retinal disseksjon, 50-100 mL Ames’-HEPES var boblet med 100% O2 i en GibcoTM 100 mL media flaske (Thermo Fisher, USA) og 50-100 mL Ames’-bikarbonat var boblet med 95% O2 og 5% CO2 i en lys-tett beholder for 15-20 min før bruk.
Retinas var forberedt som beskrevet i «Retina-disseksjon’ – seksjonen og som er lagret i en lys tett beholder med Ames’-bikarbonat boblet med 95% O2 og 5% CO2 for å opprettholde fysiologisk pH., Dette inkubasjon tilstanden er identisk med den som brukes av retinal fysiologer for ex vivo electroretinogram opptak eller sug elektrode opptak , og kan opprettholde vev levedyktighet og funksjonalitet i flere timer. En halvert stykke rektangulære trimmet retina ble brukt for hver peeling prosedyren. Vevet ble overført via en 1,7 mL plast overføre pipetter (tips cut) til en 35 x 10 mm petriskål som inneholder oksygenrikt Ames’-HEPES. Media var oppdateres hvert 10 min under peeling prosessen for å opprettholde oksygenrikt staten., Netthinnen i løsningen ble orientert med photoreceptor siden vendt ned ved hjelp av pinsett og overføre pipetter. 5 mm x 2,5 mm rektangulært stykke filter papir kutt fra VWR grade 413 filter papir (diameter 5,5 cm, porestørrelse 5 mikrometer, VWR, USA) ble plassert i petriskålen ved siden av netthinnen. Retina ble forsiktig flyttet med pinsett (lett å holde kantene) på filterpapir med photoreceptor side ned. Når retina var sentrert på filter papir, begge var nøye løftet ut av Ames’-HEPES., Den nederste siden av filter papir (siden uten retina) ble fjernet på papir håndkle til å suge opp væske på filterpapir (2-3 dabs). Dette skapte en sikker vedheft mellom photoreceptor celler og fibre av filterpapir, og dette vedlegget var viktig for å fjerne ROS lag. En dråpe av Ames’-HEPES fra petriskålen ble plassert på netthinnen, og filterpapir fjernet igjen på tørkepapir. Dette ble gjentatt en av totalt tre ganger., Filterpapir med retina ble deretter lagt tilbake i petriskålen og senkes, og vev fjernet fra filterpapir med pinsett. Omsorg ble tatt berører bare den ekstreme omkretsen av netthinnen å bevare retina strukturelle integritet. For å forenkle peeling prosess, kantene av netthinnen var forsiktig skrelt bort fra filter papir fra hver side, løsne vedheft av netthinnen til filter papir., Når retina ble fjernet fra filterpapir, bunnen av filteret papir ble fjernet på et papirhåndkle og legges i et rør merket +ROS, og ble holdt på isen. Peeling prosessen beskrevet over ble gjentatt ca 7-8 ganger. Etter 5 peeling, retina ble tynnere, mer gjennomsiktig, og var utsatt for slitasje. Etter peeling, den +ROS-rør som inneholder de innsamlede filter papirer og de resterende skrelt halvert retina ble plassert i -ROS rør, frosset på tørris og lagret ved -80 °C.,
Separasjon av photoreceptor avdelinger ved skrelling lyofiliserte retina
Denne metoden ble tilpasset fra det som er beskrevet av M. E. Guido, et al. , som utviklet en ScotchTM tape peeling metode som benyttes for lyofilisert dama retinas til selektivt å skille retina inn i forskjellige lag (photoreceptor celler, indre kjernefysiske lag, og ganglion celler)., Siden retinas fra ulike dyremodeller har forskjellige stang og membran-distribusjoner, og kan skille asymmetrisk med tape etter lyophilization, vi tilpasset denne metoden og utforsket sine verktøy for separasjon av stang lommer av musen retinas.
Fryse-tørking av isolert retinas
Retinas var forberedt som beskrevet i «Retinal disseksjon» – delen. Kaldt Ringer ‘ s (130 mM NaCl, 3.6 mM KCl, 2,4 mM MgCl2, 1,2 mM CaCl2, 10 mM HEPES, 0,02 mM EDTA, pH 7.4) ble brukt under disseksjonen. Andre fysiologiske buffere, for eksempel Ames’-HEPES, kan også brukes., Fordi flere prøver ble ofte behandlet på samme tid, 5 x 2,5 mm filter papir biter (Whatman® Karakteren 1 Kvalitative filter papir (diameter 9 cm, porestørrelse 11 µm, GE Healthcare, USA)) ble merket i forkant av tiden før de ble plassert inn i en petriskål som er fylt med kaldt Ringer ‘ s buffer. For hver prøve, en halvert, rektangulært stykke retina var plassert på filter papir ved hjelp av en 1,7 mL overføre pipetter (cut tips) med ganglion celle side ned og photoreceptor ytre segment side opp., Når vev var sentrert på filter papir, begge ble løftet ut av Ringer er buffer og bunnen av filteret papir (siden uten retina-på det) ble fjernet på et papir håndkle (2-3 dabs) for å tilrettelegge for feste av ganglion celle lag på filterpapir. En slipp av kaldt Ringer-tallet var plassert på netthinnen, og filterpapir bunnen ble igjen fjernet på papir håndkle. Dette ble gjentatt en av totalt tre ganger. Ringer er bufferen ble byttet ut for ny kald Ringer er bufferen etter hver prøveopparbeidelse., Filterpapir med vedlagte retina ble plassert i en petriskål som er fylt med kaldt Ringer før alle prøver ble behandlet på samme måte. Til slutt, hver igjen ble løftet ut av løsningen, bunnen av filteret papir fjernet tørr, og en slipp av kaldt PBS plassert på filter papir ved siden av netthinnen, bunnen av filteret igjen fjernet, og plassert i et rent og tørt 35 x 10 mm petriskål. Formålet med dette tiltaket var å skylle av de mer komplekse Ringer med PBS for å redusere mengden av tørket salt på ampullen med lyofilisert vev., Etter alle vevsprøver hadde blitt behandlet med denne siste skyll trinn og samlet inn de rene petriskål, parabolen ble pakket lett fast med to lag på 2,5 × 2,5-tommers kvadrat stykker av aluminiumsfolie, med små hull, slik at de mørke tilpasset retina-prøvene er ikke eksponeres for lys, og raskt frosset i flytende N2. Små hull tillatt flytende N2 tilgang til det indre, fylling petriskål, og omsorg ble tatt for å sikre at hullene ble forskjøvet slik at mangfoldet ble pakket lys tett., Petriskålen ble deretter plassert i en 600 mL Labconco kolbe ved hjelp av en VirTis Benkeplaten 2 K Lyophilizer (SP Vitenskapelige, USA) for 30 min til lyophilize vevet.
Avskalling av retinal lag av ScotchTM tape
Fryse-tørket retinal vev ble lagret ved -80 °C i en DrieriteTM (W. A. Hammond Drierite Co, USA) som er fylt beholder eller var isolert som +ROS, +RIS og ROS/RIS-utarmet vev (-OIS), fryst igjen som ovenfor eller behandlet for Western blot samme dag. Alle peeling prosedyrer ble utført under vanlig lys. Strimler mindre enn 2.,5 mm i bredden ble kuttet og plassert på kanten av tape dispenser til trimmet inn i rektangulære stykker. En lyofiliserte retina fast til Whatman® filter papir ble plassert i en ren 10 cm petriskål. Et lite rektangulært stykke ScotchTM tape (litt større enn overflaten av vev) ble kuttet og nøye lagt på toppen av ampullen med lyofilisert netthinnen. Å plassere tape på toppen av ampullen med lyofilisert retina var nesten nok til å feste den oransje-fargede ROS laget å tape., For å sikre full kontakt for ROS med tape, for lite press ble brukt med pinsett til toppen av tape for å sikre kontakt med overflaten. Etter nøye peeling bort tapen, den oransje-fargede ROS laget ble festet til tape og er atskilt fra resten av netthinnen. Denne fraksjonen ble merket +ROS og plasseres i en ren microfuge rør. Ofte, en tynn, hvit film var synlig på bruddflate av det oransje laget på første tape peeling., Denne overflaten ble fjernet av mer tape peeling før det ble helt fjernet, og den oransje fargen på ROS laget ble brakt til overflaten. Denne hvite laget i utgangspunktet knyttet til ROS var plassert i et eget rør og merket +RIS brøkdel. Tapen ble brukt til å fjerne rester retinal vev fra filterpapir og ble plassert inn i en t-merket-OIS., Hvor mye press som er brukt til å tape for den første trekk av den oransje-fargede ROS lag påvirket hvordan det lyofiliserte eksempel fractioned; for mye press forårsaket hele lyofiliserte netthinnen løsner filteret papir på tape og for lite press ikke skiller de oransje lag fra netthinnen. Et par passerer over båndet og bruker minimalt press med pinsett var nyttig i følelsen ut minimum og maksimum mengde press for å legge til toppen av båndet.,
klargjøring for Western blot: peeling med filterpapir
+ROS rør som inneholder filter papir ble utsatt for en rask runde i en mikrosentrifuge for 2 s og overflødig væske fjernes. Hvert rør ble behandlet enkeltvis (en halvert retina) eller to rør (to halvert retinas) ble kombinert for mer konsentrert materiale. Den +ROS isolere i et enkelt rør var homogeniserte i 45-60 µL av kalde RIPA buffer buffer (50 mM Tris–HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% natrium deoxycholate, 0.1% SDS, 1 mM EDTA, 0.,1 M PMSF, komplett mini protease inhibitor (Roche Applied Sciences)), og -ROS isolere i et enkelt rør var homogeniserte i 80-100 µL RIPA buffer. Når to rørene ble kombinert, 80-110 µL av kalde RIPA buffer ble brukt til å homogenize +ROS og 100-150 µL av kalde buffer ble brukt for ROS. Alle rørene var homogeniserte for 1 min med en den må byttes ut stampe. Det ble utvist stor forsiktighet for å sikre at filteret papir stykker i +ROS rørene ble holdt på siden av rør og bodde i kontakt med stampe i stedet for å bli sittende fast i bunnen., Etter homogenisering, steril pinsett ble brukt til å flytte filter papir stykker til side av +ROS rør, etterfulgt av 2-4 s spinn i mikrosentrifuge. Dette spinn ekstraherte væsken fra papir, og den væsken som ble overført til et rent rør og behandles for Western blot som beskrevet nedenfor. Dette var den mest tidkrevende trinn, og hvis det ikke gjøres riktig, mye av prøven kan ende opp med å bli absorbert av biter av filter papir. For å maksimere utvinning av prøven, størrelsen på filter papir biter som brukes for peeling bør bli beskåret for å matche området av retinal vev.,
prøveopparbeidelse: peeling med ScotchTM tape
Lik filter peeling metode, to rør, som hver inneholder en skrelt lag fra en halv retina, ble kombinert for å øke protein konsentrasjon. +ROS og +RIS prøvene ble homogeniserte i 100-115 µL, og -OIS prøver i 125 µL av kalde RIPA buffer. Alle rørene var homogeniserte for 1 min. Stor omsorg ble tatt for å være sikker på at tape i +ROS, +RIS, og -OIS rør bodde i kontakt med stampe og at tapen ble holdt på siden av rør i stedet for å bli sittende fast i bunnen., Etter homogenisering, steril pinsett ble brukt til å flytte biter av tape til siden av rørene. Rørene ble spunnet i mini-sentrifuger for 2-4 s, etter som den tørkede biter av tape ble omhyggelig fjernet.
Protein kvantifisering, gel elektroforese og protein immunoblots
EN BCA protein assay kit (Thermo Scientific, USA) ble brukt til å bestemme den totale mengden av protein i hver prøve. To microliter av DNaseI (10 enheter/µL, Roche, Sveits) ble tilsatt prøvene og ble til venstre ved romtemperatur i 30 min., Passende volum av 4X SDS eksempel buffer (40% glyserol, 240 mM Tris Base pH 6.8, 8% SDS, 5% ßME, 0.04% Bromophenol blå) ble lagt til homogenate.,tr>
Approximately 10 μg of protein lysate was loaded per lane and separated on a pre-cast polyacrylamide Bis-Tris gel with a 4–12% gradient (Life Technologies, USA) and transferred onto nitrocellulose membrane., Membraner ble blokkert i 10% melk/TBS-T buffer for 1 h på RT, og inkubert over natten med følgende antistoffer: kanin anti-ARR1 antistoff (1:1000, ref), mus anti-GNAT1 monoklonalt antistoff (TF-15, 1:1000, CytoSignal), kanin anti-β actin antistoff (1:5000, GeneTex Inc.), kanin anti-RGS9 antistoff (1:1000), kanin anti-Gß5L/S (CT215) (1:2000), og kanin anti-cytokrom C polyklonale antistoffer (1:500, Santa Cruz, sc-7159). Membraner ble inkubert med fluoriserende fargestoff sekundær antistoffer (1:10,000, LI-COR Biovitenskap) på RT for 1 h., Protein-bånd ble oppdaget av Odyssey® infrarød imaging system (LI-COR Biovitenskap, USA) og fluorescens intensitet av individuelle band ble kvantifisert ved hjelp av ImageJ. GNAT1, ARR1 og RGS9 signaler som var normalisert mot Gß5L for +ROS, +RIS prøver, og mot actin for ROS og -OIS prøver. For hver uavhengige eksperiment, fluorescerende signaler for hver protein i hvert rom var også normalisert mot kombinert signaler fra alle retinal lommer. Gruppert 2-tailed t-tester ble brukt til å bestemme forskjeller mellom to grupper.