Differensial migrering av holo – og apo-metalloproteins av MIKROFONER-BN-SIDE
Mens ingen separasjon av holo- (Fe2-transferrin (Tf)) og apo-Tf ble observert i konvensjonelle 1D innfødte (CBB G-250 gratis)-SIDE (Fig. 1a) og SDS-PAGE (Fig., 1b), interessant, vi fant ut at holo – og apo-Tf er helt separert ved hjelp av MIKROFONER-BN-SIDE (Fig. 1c) (det bør bemerkes at to band ble observert for en «ren» apo-Tf eksempel ved hjelp av BN-SIDE uten MIKROFONER-modus på grunn av metall-ion-forurensning; Supplerende Fig. S1). I SDS-PAGE, dette er sannsynligvis på grunn av dissosiasjon av metall-ioner fra holo-former som oppstår under sterk denaturing conditions14,15 (data ikke vist). Dette faktum antyder at elektroforetiske anerkjennelse mellom holo – og apo-skjemaer er ikke tilgjengelig for konvensjonelle SIDE metoder., Disse resultatene antyder at spesifikke svake denaturing agenter, som CBB-G 250 ansatt i MIKROFONER-BN-SIDE, gjenkjenne forskjellen mellom holo – og apo-metalloproteins å øke avstanden, i tillegg til å unngå metall dissosiasjon.
på Ulike vis atferd for holo – og apo-skjemaer ble også observert for ceruloplasmin (Cp) som er bundet med Cu2+ (Cu-Cp) og superoxide dismutase (SOD) bundet med Cu2+ og Zn2+ (Cu/Zn-SOD) av MIKROFONER-BN-SIDE-metoden (Fig. 1d,e). Apo-skjemaer overført til stillinger i nærheten korrespondanse med sine nøyaktige molekylære vekter i MIKROFONER-BN-SIDE (Fig., 1: Tf, 77 kDa; Cp, 134 kDa; TORV, 32 kDa), noe som er nyttig når det gjelder å identifisere proteiner. Som beskrevet i Innledningen, er disse funnene førte oss til å utvikle holo/apo-konvertering (HAC)-2D-MIKROFONER-BN-SIDE metodikk for selektiv isolering av holo-metalloproteins.
Begrepet holo/apo-konvertering 2D-MIKROFONER-BN-SIDE
Vår nye 2D SIDE-metoden basert på differensiell migrasjon mellom holo – og apo-metalloproteins, begynner med en MIKROFONER-BN-SIDE scenen gjennomført i to kjørefelt (kjørefelt A og B i Fig., 2, – panelet I) å tillate for separasjon av holo – og apo-metalloproteins fra en prøve som inneholder både metalloprotein former. De to kjørefelt er så utsatt for to ulike behandlinger etter den første MIKROFONER-BN-SIDE separasjon: Lane En er utsatt for en andre MIKROFONER-BN-SIDE scenen, men bare etter å ha gjennomgått en holo/apo-konvertering behandling (Fig. 2 panel II-1), mens Lane B er levert til en metalldetektering SIDE scenen for å avgjøre metall ioner som er forbundet med den utskilte proteiner (Fig. 2 panel II-2). Behandlingen brukes til Lane B har tidligere blitt validert., For eksempel, fastsettelse av noen tunge metall ioner (Cu2+, Fe3+, Co3+, Ni2+, Mn2+, og Cd2+) i små volum (µL) prøver i ppt og sub-ppb nivåer av denne SIDEN metode uten bruk av en ren rom har blitt reported21. Videre, dette tandem 1D MIKROFONER-BN-SIDE/metalldetektering SIDE metodikk avslørt den nøyaktige fordelingen av Cu2+ i humant serum selv for svakt albumin-bundet (utskiftbar) Cu2+ 21, og foreslo at periplasmic Rubrivivax gelatinosus CopI protein sterkt involvert i kobber motstand er en kobber-bindende protein22., Likevel, til helt å identifisere metall-bundet til proteiner i en kompleks protein eksempel er vanskelig på grunn av co-migrere proteiner. Det har For eksempel ikke vært fullt ut bevist at CopI er en kobber-bindende protein i R. gelatinosus, selv om sekvensen har tre antatte Cu-bindende områder: (i) en type 1 kobber center til stede i mange cupredoxins som azurin og plastocyanin, (ii) en Histidin-rik-i-N-terminus rekkefølge, og (iii) en Histidin/Metionin-rik rekkefølge. CopI-relaterte proteiner er til stede i mange bakterier, men er ikke mye som er bevart, for eksempel, det er fraværende fra Escherichia coli22., Så langt, bare proteiner av R. gelatinosus og Vibrio cholerae har vært studert, og er involvert i Cu resistance22,23. I R. gelatinosus, CopI protein er høyt uttrykt i nærvær av Cu2+, men Cu-avgiftning-mekanismen er fortsatt ukjent. Dermed er en metode for isolering av metalloproteins fra alle andre proteiner, co-eksisterende i komplekse biologiske prøver er nødvendig.
Konseptet av HKS-2D-MIKROFONER-BN-SIDE/metalldetektering SIDE metodikk., Panelet jeg: 1D MIKROFONER-BN-SIDEN i to kjørefelt. Lane A ble utsatt for i-gel holo/apo-konvertering prosedyre (som i Panelet II-1), og deretter Lane A ble utsatt til 2D-MIKROFONER-BN-SIDE etter holo/apo-konvertering (som i Panel III). Lane B ble utsatt for Cu2+ og Fe3+ deteksjon SIDE (som i Panelet II-2). 2D electropherogram er for en blanding av metalloproteins (holo-Tf, apo-Tf, holo-Cp og holo-SOD), som i holo-metalloproteins i det opprinnelige utvalget var isolert som flekker av diagonal linje (stiplet gul linje i Panel III). Full-størrelse versjoner av electropherograms representert i Fig., 2 er vist i Fig. S2.
for Å overvinne denne begrensningen, informasjon gitt av 1D MIKROFONER-BN-SIDE/metalldetektering SIDE analyse av Lane B er utvidet ved å utsette Lane En til en annen dimensjon av MIKROFONER-BN-SIDE etter holo/apo-konvertering. For å gjennomføre denne analysen, Lane En er først dyppet i en syrlig, metall chelator løsning (se Metoder delen og Supplerende for detaljerte krav) for holo/apo-konvertering (Fig. 2 panel II-1)., I så å gjøre, holo-metalloproteins er derivatized i metal-gratis apo-metalloproteins i gelen på den første SIDEN dimensjon. De behandlet Lane En blir så levert til andre MIKROFONER-BN-SIDE scenen med hjelp av en metall-gratis agarosegel (se Utfyllende Informasjon). I den andre MIKROFONER-BN-SIDE scenen (Fig. 2, panel III), apo-metalloproteins og ikke-metalloproteins fra den opprinnelige prøven migrere på diagonal linje, siden overføringen av disse artene er på den andre SIDEN dimensjon er helt identisk med sin vandring på den første SIDEN dimensjon., På den annen side, holo-metalloproteins fra den opprinnelige prøven migrere ulike avstander i første og andre MIKROFONER-BN-SIDE dimensjoner, siden disse proteinene vandrer som deres holo-former i den første dimensjonen og som deres apo-former i den andre dimensjonen (og siden MIKROFONER-BN-SIDE resultatene i en annen elektroforetiske mobilitet for holo – og apo-former av metalloproteins; vide infra). Dermed ble det bare holo-metalloproteins fra den opprinnelige prøven migrere av diagonal linje i den andre dimensjonen, å bli identifisert av MALDI-TOF MS uten noen ekstra protein rensing., Typer og mengder av metall-ioner bundet med metalloproteins i den opprinnelige prøven løsning (de isolert som off-diagonal flekker), kan være bestemt av metall deteksjon SIDE av Lane B, som beskrevet ovenfor. Derfor, informasjon knyttet til identifisering og distribusjon av metalloprotein arter, sammen med identiteter og konsentrasjoner av metall-ioner binder de, og er tilgjengelig fra denne nye HAC-2D-MIKROFONER-BN-SIDE/metalldetektering SIDE metodikk.,
Selektiv isolering av metalloproteins i HKS-2D-MIKROFONER-BN-SIDE
For proof-of-concept, HAC-2D-MIKROFONER-BN-SIDE/metalldetektering SIDE ble vist for et utvalg blanding som inneholder holo-Tf, apo-Tf, holo-Cp og holo-SOD protein standarder (som resulterer i 2D electropherogram i Fig. 2, panel III), og også for et humant serum prøve (Supplerende Fig. S3). Flekker av holo-metalloproteins at migrert av den diagonale linjen ble vellykket observert for blandet protein eksempel., I tillegg, Fe3+ ble funnet på posisjon av holo-Tf, og Cu2+ i stillinger av holo-Cp og holo-SOD, i første MIKROFONER-BN-SIDE scenen ved hjelp av metall deteksjon SIDE. Hvis ingen holo/apo konverteringen er utført, alle proteiner vandrer på diagonal linje (Supplerende Fig. S5). For et humant serum eksempel, holo-Tf og holo-Cp ble vellykket oppdaget (Supplerende Fig. S3)., Dermed ble det konkludert med at HKS-2D-MIKROFONER-BN-SIDE/metalldetektering SIDE er svært effektiv for isolasjon av holo-metalloproteins og identifisering av metall-ioner opprinnelig bundet til å metalloproteins i et protein blanding.
til Slutt, HAC-2D-MIKROFONER-BN-SIDE metoden ble brukt til en total bakteriell løselig protein brøkdel innhentet fra R. gelatinosus celler dyrket i nærvær av 1,2 mM Cu2+, uttrykke CopI protein. Dette representerer en biologisk protein eksempel., For denne prøven, et sted utenfor diagonal linje som ble funnet på posisjon på 100 kDa og 29 kDa i første og andre SIDE, henholdsvis (Fig. 3a). En høy konsentrasjon av Cu2+ ble observert ved posisjonen til 97-139 kDa i første MIKROFONER-BN-SIDE (Fig. 3b). Følgelig, det ble konkludert med at proteinet i dette punktet har Cu ion bundet til det. Stedet ble kuttet og deretter analysert av MALDI-TOF MS Peptider tilsvarende CopI ble identifisert (Fig. 3c, Supplerende Fig. S7 og Tabell S1)., I tillegg, når denne gelen stedet ble kjørt på SDS-PAGE, et enkelt band av CopI protein ble observert (data ikke vist). En annen spot off av den diagonale linjen ble observert på rundt 40 kDa (over 29 kDa CopI sted i den andre dimensjonen (Fig. 3a)). Det ble bekreftet av MALDI-TOF MS at dette punktet også stammer fra CopI (og trolig var en dimer av CopI i henhold til molekylvekt). Dermed, en metalloprotein kan være spesielt isolert fra en protein kompleks blanding, mens også å identifisere sine bundet metall., Denne analysen av HKS-2D-MIKROFONER-BN-SIDE definitivt bevist at CopI er en kobber bindende-protein, og det er interessant at denne egenskapen kan være relatert til protein er Cu-avgiftende funksjon i den bakterielle periplasm. Ytterligere kvantitative analyse avslørte stoichiometry av Cu-ion-å CopI som 1:1 (basert på konsentrasjonene av de bundet Cu-ion (1.05 µM) og av holo-CopI protein (0.95 µM) som bestemmes av CBB R-250 farging). Dette er i sum avtale med andre eksperimentelle resultater, som fant en Cu:CopI stoichiometry av 1:1.2 ved hjelp av ICP-MS med ren CopI (Durand et al.,, upubliserte data). Dette resultatet tyder på at vår metode er også nyttige for undersøkelser av metalloprotein stoichiometries.
HAC-2D-MIKROFONER-BN-SIDE ansette sølv farging (a), med Cu2+ deteksjon SIDE (b), av en løselig fraksjon innhentet fra R. gelatinosus celler dyrket i nærvær av 1,2 mM Cu2+ (total protein: 31.5 µg). Off-diagonal sted angitt med stjerne i (a) ble utsatt for MALDI-TOF MS (Supplerende Fig., S7), identifisere sekvensene vises i rød skrift som en del av CopI modne sekvens (c). Full-størrelse versjoner av electropherograms representert i Fig. 3 er avbildet i Supplerende Fig. S8.
Kapillær elektroforese eksperimenter for å undersøke molekylær anerkjennelse moduser
oppløsning ekstrautstyr mellom holo – og apo-former i MIKROFONER-SIDE bistått med CBB fargestoff (Fig., 1 c–e) er en viktig nøkkel til vår metodikk, og, interessant nok, dette molekylær anerkjennelse synes å stamme fra forskjellige tall i CBB G-250 fargestoffer binding til hver av holo – vs. apo-former av metalloproteins. Dette, i sin tur, sannsynligvis resulterer i ulike effektiv avgifter, og/eller indusert steriske strukturer, for dye-protein komplekser. Begge disse effektene vil påvirke elektroforetiske mobilitet., For å få en dypere innsikt med hensyn til godkjenning mekanisme av CBB G-250 fargestoff binding mot holo – og apo-Tf, CE eksperimenter ble gjennomført, sammen med docking simuleringer ved hjelp av AutoDock Vina program24,25 (vide infra). CZE er gjennomført i gratis vandig løsning uten gel matrise, og så en molekylær sikting effekt må ikke bli vurdert i simuleringer. Den elektroforetiske mobilitet av holo-Tf målt ved CZE var åpenbart forskjellig fra apo-Tf med tillegg av CBB fargestoff (Fig. 4), mens disse proteinene hadde identiske mobilities i fravær av fargestoff., Dette faktum tyder sterkt på at antall fargestoff molekyler bundet med holo – og apo-metalloproteins er forskjellige. I CZE, migrering av protein-dye komplekse ville være hovedsakelig påvirket av effektiv lading av komplekset, som, i sin tur, vil være påvirket av antall enkeltvis-ladet anioniske CBB fargestoff molekyler bundet til protein.,
Typisk electropherograms fra CZE eksperimenter for: 10 µM holo – eller apo-Tf uten CBB G-250 (øverste grønne spor); og blandinger som inneholder 5 mM CBB G-250 fargestoff med 10 µM holo-Tf (i midten blue trace) eller med 10 µM apo-Tf (nedre rød spor).,
Tradisjonelt, elektroforetiske mobilitet av et protein i gratis løsning er representert ved Henry ligningen, som vist i ligning (1):
Her, Q, η, R og k representerer netto kostnad, løsningen viskositet, radius av protein, og den inverse Debye lengde av elektrolytt løsning. Henry funksjon, H, øker monotonically fra 2/3 til 1., Strengt tatt er denne formelen gjelder utelukkende en sfærisk molekyl med en centrosymmetric lade distribusjon, selv om det er noen diskusjoner for å endre Henry ligningen til å gjelde ikke-sfæriske proteiner med komplekse lade distribusjon (inkludert dipol og quadrupole)26. I vårt tilfelle, holo – og apo-Tf-molekyler er deformert sfærer av svært lik størrelse (ligner spheroids med lang og kort aksen lengder på ca 92 og 60-Å (holo-Tf), og 93 og 68 Å (apo-Tf), henholdsvis) (Supplerende Fig. S9)., I tillegg dipol og quadrupole er forventet å ha en mindre effekt på mobilitet siden CBB G-250 molekyler bundet til holo-/apo-Tf er ikke lokalisert, som vist i Supplerende Fig. S9 (se nedenfor). Resultatene av presise beregninger av Kim et al.26 viser at elektroforetiske mobilitet av en spheroidal protein ikke er vesentlig påvirket av en quadrupole i løsninger av lave ioniske styrke (jeg < 0,01 M), og ionic styrken av separasjon buffer i vår CZE eksperimenter ble tilsvarende lav (I = 0.013 M).,
Derfor, forholdet mellom elektroforetiske mobilities av apo – og holo-Tf complexed med CBB G-250 fargestoff (nemlig, µApo/µHolo), er knyttet til forholdet mellom netto kostnader til hver komplekset (nemlig, QApo/QHolo), som lett kan bli avledet fra Henry ligningen. Negative netto kostnader av Tf-CBB G-250 komplekser i hovedsak stammer fra den bindende antall fargestoff. Følgelig verdien av µApo/µHolo gir også forholdet mellom fargestoff tall (nemlig, NApo/NHolo). Eksperimentelt, forholdet mellom elektroforetiske mobilities av de to former for Tf (µApo/µHolo = (-2.69 × 10-4)/(-2.,09 × 10-4)) ble funnet å være 1.29 av CZE (Fig. 4), som svarer til forholdet mellom effektiv elektrisk ladning, forutsatt størrelser av begge former av Tf er lik. Derfor, forholdet mellom elektroforetiske mobilities bør enig med forholdet mellom fargestoff molekyler bundet. Imidlertid, i en videre diskusjon av forholdet mellom elektroforetiske mobilitet og protein formen for andre metalloproteins er nødvendig i tilfeller når holo – og apo-protein forskjellige former (som for Cp).,
Molekylær docking simulering eksperimenter for å undersøke molekylær anerkjennelse moduser
Farge bindende var bestemt av fleksible molekylær docking-simuleringer av AutoDock Vina27, designet for å uttømmende søk etter bindende områder og til å beregne sine gratis energier (Fig. 5 og Supplerende Fig. S9). Nylig, Wang et al.25 rapportert at AutoDock Vina har en høy scoring makt og middels prøvetaking makt i forhold til andre brukte docking-programmer., I henhold til disse simuleringene, et større antall CBB G-250 fargestoff molekyler bundet til ledige Fe-bindende områder i apo-Tf i forhold til holo-Tf (Fig. 5a) ble observert. Basert på disse Autodock Vina simuleringer, forholdet til fargestoff-bindende antall NApo/NHolo ble funnet å være 1.23, med en bindende energi <-6.5 kcal/mol (tilsvarende K~104.4 M−1) (Fig. 5b for dye-bindende antall kumulativ frekvens fordeling som en funksjon av bindende energi), som er i god overensstemmelse med våre CZE resultatene, som er diskutert tidligere (NApo/NHolo = 1.29)., Kvantitative bindende antas med tillegg av fargestoff i mM nivåer (over 95% av bindende områder samhandle med fargestoff når logg K er 4,4 eller større), som i disse eksperimentene.
bindende rekke fargestoffer med holo-Tf ble også undersøkt av CZE eksperimenter (data ikke vist), som bedømmes fra reduksjon av gratis fargestoff topp for en 1 mM CBB G-250 fargestoff eksempel med og uten tillegg av 10 µM holo-Tf., Siden bindende tallet ble den målt til å være >18, bindende antall NHolo ble antatt å være >20 i MIKROFONER-BN-SIDE eksperimenter (med 3,0 mM farge tilføyd). Dette bindende rekke fargestoffer (>20) fra CZE eksperimenter er i god avtale med antall bundet fargestoffer (N = 21) fra molekylære docking-simuleringer som ville gi opphav til spådd affinitet av -6.5 kcal/mol, og slik at våre resultater er selv-konsistent.,
Det er sett fra disse molekylære docking-simuleringer og CZE eksperimenter som CBB G-250 fargestoff gjenkjenner de ulike kjemiske strukturer av holo – og apo-metalloproteins å gi forskjellig µ verdier. Mer detaljerte observasjoner av den simulerte bindende moduser foreslår også at CBB G-250 molekyl samhandler med aminosyre rester tilgjengelig på grunn av den mer åpne (utfoldet) apo-Tf struktur i forhold til de mer lukket (foldet) holo-Tf struktur, mens fargen viser ingen bindende direkte med Fe-bindende aminosyre rester (Asp392, Tyr429, Tyr517 og Hans 585)., Dermed er det underforstått at fargestoffet gjenkjenner små forskjeller mellom brettet og utfoldet kjemiske strukturer av metalloproteins, som er indusert av bindende eller dissosiasjon av metall-ioner. Slike små forskjeller ikke kan bli identifisert av andre konvensjonelle metoder for separasjon.
Aminosyre rester kontakte fargestoff molekyler i hver farge-bindende nettstedet i simulering (for eksempel Supplerende Fig. S10) ble kategorisert i henhold til deres dominerende arten: hydrofobe, hydrofile, eller elektrostatisk ladning (som oppsummert i Supplerende Tabell S2 og Tabell S3)., I henhold til resultatene, er det bestander av hver type aminosyre i samspill med fargestoffer viste ingen forskjell mellom holo – og apo-protein former (26-27% for hydrofobe, 37-40% for hydrofile, 33-35% belastet for rester i hver form). Imidlertid, antall hydrogen obligasjoner i apo-Tf (33 totalt; 1.2 per bindende nettstedet) var betydelig større enn i holo-Tf (19 sum; 0.9 per bindende nettstedet). Ved å fokusere på de åtte bindende områder i apo-Tf som ikke var tilstede i holo-Tf (Supplerende Tabell S3), antall H-obligasjoner per nettstedet ble funnet å være 2.1., Disse resultatene antyder sterkt at endringer i hydrogen bond vekselsvirkningene er først og fremst ansvarlig for differensiering mellom holo – og apo-Tf former, mens ytterligere undersøkelser som ville være nødvendig for å forstå hele mekanismen.