het 16S rRNA-gen wordt gebruikt voor fylogenetische studies, omdat het in hoge mate geconserveerd wordt tussen verschillende soorten bacteriën en archaea. Carl Woese (1977) was de pionier van dit gebruik van 16S rRNA. Men stelt voor dat het gen van 16S rRNA als betrouwbare moleculaire klok kan worden gebruikt omdat de opeenvolgingen van 16S rRNA van verre verwante bacteriële lijnen worden getoond om gelijkaardige functionaliteiten te hebben. Sommige thermofiele archaea (b.v. orde Thermoproteales) bevatten 16S rRNA gen introns die in hoogst behouden gebieden worden gevestigd en het ontharden van “universele” inleidingen kunnen beà nvloeden., Mitochondriale en chloroplastische rRNA worden ook versterkt.
het meest voorkomende primerpaar werd bedacht door Weisburg et al. (1991) en wordt momenteel aangeduid als 27F en 1492R; echter, voor sommige toepassingen kunnen kortere amplicons nodig zijn, bijvoorbeeld voor 454 sequencing met titaniumchemie het primerpaar 27F-534R die v1 aan V3 behandelen.Vaak wordt 8F gebruikt in plaats van 27F. de twee primers zijn bijna identiek, maar 27F heeft een M in plaats van een C. AGAGTTTGATCMTGGCTCAG vergeleken met 8F.,
| Primer name | Sequence (5′-3′) | Ref.,td> | |
|---|---|---|---|
| 805R | GAC TAC CAG GGT ATC TAA TC | ||
| 533F | GTG CCA GCM GCC GCG GTA A | ||
| 518R | GTA TTA CCG CGG CTG CTG G | ||
| 1492R | CGG TTA CCT TGT TAC GAC TT |
PCR and NGS applicationsEdit
In addition to highly conserved primer binding sites, 16S rRNA gene sequences contain hypervariable regions that can provide species-specific signature sequences useful for identification of bacteria.,Dientengevolge, is het 16S rRNA gen rangschikken overwegend in medische microbiologie geworden als snel en goedkoop alternatief aan phenotypic methodes van bacteriële identificatie. Hoewel het oorspronkelijk werd gebruikt om bacteriën te identificeren, werd het rangschikken van 16S later gevonden om bacteriën in volledig nieuwe species, of zelfs te kunnen herclassificeren genera.It is ook gebruikt om nieuwe soorten te beschrijven die nooit met succes zijn gekweekt.,Met derde generatie die aan vele laboratoria komen rangschikken, is de gelijktijdige identificatie van duizenden opeenvolgingen van 16S rRNA mogelijk binnen uren, die metagenomic studies, bijvoorbeeld van darmflora toestaan.
Hypervariabele regionedit
het bacteriële 16S-gen bevat negen hypervariabele gebieden (V1-V9), variërend van ongeveer 30 tot 100 basenparen lang, die betrokken zijn bij de secundaire structuur van de kleine ribosomale subeenheid., De mate van instandhouding varieert sterk tussen hypervariabele regio ‘s, met meer geconserveerde regio’ s die correleren met hogere taxonomie en minder geconserveerde regio ‘ s met lagere niveaus, zoals geslacht en soorten. Terwijl de volledige opeenvolging van 16S voor vergelijking van alle hypervariable gebieden toestaat, bij ongeveer 1.500 lange basisparen kan het prohibitief duur zijn voor studies die diverse bacteriële gemeenschappen proberen te identificeren of te karakteriseren., Deze studies gebruiken Algemeen het Illumina-platform, dat leest bij tarieven 50-voudig en 12.000-voudig minder duur dan 454 pyrosequencing en sanger het rangschikken, respectievelijk veroorzaakt. Terwijl goedkoper en het toestaan van diepere gemeenschapsdekking, produceert Illumina het rangschikken slechts leest 75-250 lange basisparen (tot 300 basisparen met Illumina MiSeq), en heeft geen gevestigd protocol voor het betrouwbaar assembleren van het volledige gen in communautaire steekproeven. Volledige hypervariabele regio ‘ s kunnen worden samengesteld uit een enkele Illumina run, echter, waardoor ze ideale doelen voor het platform.,
terwijl 16S hypervariabele regio ‘ s dramatisch kunnen variëren tussen bacteriën, behoudt het 16S gen als geheel een grotere lengtehomogeniteit dan zijn eukaryotische tegenhanger (18S ribosomaal RNA), wat alignments gemakkelijker kan maken. Bovendien bevat het 16S-gen hoogst bewaarde opeenvolgingen tussen hypervariable gebieden, die het ontwerp van universele inleidingen toelaten die betrouwbaar dezelfde secties van de 16S-opeenvolging over verschillende taxa kunnen veroorzaken. Hoewel geen hypervariabele Regio alle bacteriën van domein aan species nauwkeurig kan classificeren, kunnen sommigen op betrouwbare wijze specifieke taxonomische niveaus voorspellen., Vele communautaire studies selecteren semi-behouden hypervariable gebieden zoals V4 om deze reden, aangezien het resolutie op het phylumniveau zo nauwkeurig als het volledige 16S gen kan verstrekken. Terwijl minder geconserveerde regio ‘ s moeite hebben om nieuwe soorten te classificeren wanneer de taxonomie van de hogere orde onbekend is, worden ze vaak gebruikt om de aanwezigheid van specifieke pathogenen te detecteren. In een studie door Chakravorty et al. in 2007, kenmerkten de auteurs de gebieden V1-V8 van een verscheidenheid van ziekteverwekkers om te bepalen welke hypervariable gebieden het nuttigst zouden zijn om voor ziekte-specifieke en brede analyses op te nemen., Onder andere merkten zij op dat het v3-gebied het beste was in het identificeren van het geslacht voor alle geteste pathogenen, en dat V6 het meest accuraat was in het onderscheiden van soorten tussen alle geteste ziekteverwekkers die door CDC werden bekeken, inclusief miltvuur.
terwijl 16S hypervariabele regio analyse een krachtig instrument is voor bacteriële taxonomische studies, worstelt het om onderscheid te maken tussen nauw verwante soorten. In de families Enterobacteriaceae, Clostridiaceae, en Peptostreptococcaceae, kunnen de species tot 99% opeenvolgings gelijkenis over het volledige 16S gen delen., Dientengevolge, kunnen de V4 opeenvolgingen door slechts een paar nucleotiden verschillen, verlaten verwijzingsdatabases onbekwaam om deze bacteriën op lagere taxonomische niveaus betrouwbaar te classificeren. Door 16S-analyse te beperken tot het selecteren van hypervariabele gebieden, kunnen deze studies verschillen in nauw verwante taxa niet waarnemen en ze groeperen in enkele taxonomische eenheden, waardoor de totale diversiteit van de steekproef wordt onderschat. Voorts kunnen de bacteriële genomen veelvoudige genen van 16S huisvesten, met de gebieden V1, V2, en V6 die de grootste intraspecies diversiteit bevatten., Hoewel niet de nauwkeurigste methode om bacteriële species te classificeren, blijft de analyse van de hypervariable gebieden één van de nuttigste beschikbare hulpmiddelen aan bacteriële gemeenschapsstudies.