de ontwikkeling, differentiatie en groei van cellen en weefsels vereisen nauwkeurig gereguleerde patronen van genexpressie. De versterkers werken als cis-regelgevende elementen om zowel ruimtelijke als temporele controle van ontwikkeling te bemiddelen door transcriptie in specifieke cellen aan te zetten en/of het in andere cellen te onderdrukken. Zo controleert de specifieke combinatie van transcriptiefactoren en andere DNA-bindende eiwitten in een zich ontwikkelend Weefsel welke genen in dat weefsel tot expressie zullen komen. De versterkers staan het zelfde gen toe om in diverse processen in ruimte en tijd worden gebruikt.,
identificatie en karakterizatiedit
traditioneel werden versterkers geïdentificeerd door middel van “enhancer trap” technieken met behulp van een reporter gen of door vergelijkende sequentieanalyse en computationele genomica. In genetisch tractable modellen zoals de fruitvlieg Drosophila melanogaster, bijvoorbeeld, kan een verslaggeversconstructie zoals het lacZ-gen willekeurig in het genoom worden geïntegreerd gebruikend een P-element transposon. Als het verslaggeversgen dichtbij een versterker integreert, zal zijn uitdrukking het uitdrukkingspatroon weerspiegelen dat door die versterker wordt gedreven., Aldus, staat het bevlekken van de vliegen voor LacZ uitdrukking of activiteit en het klonen van de opeenvolging toe die de integratieplaats omringt de identificatie van de versterkeropeenvolging toe.
de ontwikkeling van genomische en epigenomische technologieën heeft echter de vooruitzichten voor CIS-regulatory modules (CRM) discovery drastisch veranderd., Next-generation sequencing (NGS) methoden nu high-throughput functionele CRM discovery assays, en de enorm toenemende hoeveelheden beschikbare gegevens, met inbegrip van grootschalige bibliotheken van transcriptie factor-binding site (TFBS) motieven, collecties van geannoteerde, gevalideerde CRM ‘ s, en uitgebreide epigenetische gegevens over vele celtypen, maken nauwkeurige computationele CRM-ontdekking een haalbaar doel. Een voorbeeld van NGS-gebaseerde benadering genoemd DNase-seq heeft identificatie van nucleosome-uitgeput, of open chromatin gebieden toegelaten, die CRM kunnen bevatten., Recentere technieken zoals ATAC-seq zijn ontwikkeld die minder grondstof vereisen. Nucelosome uitgeputte gebieden kunnen in vivo door uitdrukking van Dammethylase worden geà dentificeerd, die voor grotere controle van cel-type specifieke versterkeridentificatie toestaan.Computationele methoden omvatten vergelijkende genomica, clustering van bekende of voorspelde TF-bindende plaatsen, en gecontroleerd machine-learning benaderingen getraind op bekende CRM ‘ s., Al deze methoden zijn effectief gebleken voor CRM-ontdekking, maar elk heeft zijn eigen overwegingen en beperkingen, en elk is onderworpen aan een groter of kleiner aantal vals-positieve identifications.In de vergelijkende genomicsbenadering, opeenvolgingsbehoud van niet-codeert gebieden kan indicatief van versterkers zijn. De opeenvolgingen van veelvoudige species worden uitgelijnd, en de behouden gebieden worden computationeel geà dentificeerd., De geà dentificeerde opeenvolgingen kunnen dan aan een verslaggeversgen zoals groene fluorescente proteã ne of lacZ worden verbonden om het in vivo patroon van genuitdrukking te bepalen die door de versterker wordt geproduceerd wanneer ingespoten in een embryo. mRNA-uitdrukking van de verslaggever kan door kruising in situ worden gevisualiseerd, die een meer directe maatregel van versterkeractiviteit verstrekt, aangezien het niet aan de complexiteiten van Vertaling en eiwit het vouwen wordt onderworpen., Hoewel veel bewijsmateriaal naar opeenvolgingsbehoud voor kritieke ontwikkelingsversterkers heeft gewezen, heeft ander werk aangetoond dat de functie van versterkers met weinig of geen primaire opeenvolgingsbehoud kan worden behouden. Bijvoorbeeld, hebben de RET-versterkers in mensen zeer weinig opeenvolgingsbehoud aan die in zebrafish, nog produceren de opeenvolgingen van beide species bijna identieke patronen van verslaggeversgenuitdrukking in zebrafish., Ook bij sterk uiteenlopende insecten (ongeveer 350 miljoen jaar van elkaar gescheiden) werden soortgelijke genexpressiepatronen van verschillende sleutelgenen gereguleerd door op dezelfde manier samengestelde CRM ‘s, hoewel deze CRM’ s geen merkbare sequentiebehoud vertonen die kan worden gedetecteerd door standaard sequentieuitlijningsmethoden zoals BLAST.
bij segmentatie van insectsEdit
behoren de versterkers die vroege segmentatie bepalen bij Drosophila melanogaster embryo ‘ s tot de best gekarakteriseerde ontwikkelaars., In het vroege vliegembryo, zijn de de transcriptiefactoren van het gapgen de oorzaak van het activeren en het onderdrukken van een aantal segmentatiegenen, zoals de genen van de paarregel. De gapgenen worden uitgedrukt in blokken langs de anterior-posterior as van de vlieg samen met andere maternale effect transcriptiefactoren, waarbij zones worden gecreëerd waarbinnen verschillende combinaties van transcriptiefactoren worden uitgedrukt. De paar-regel genen worden van elkaar gescheiden door niet-expresserende cellen. Bovendien worden de strepen van expressie voor verschillende paarregelgenen gecompenseerd door een paar celdiameters van elkaar., Aldus, creëren de unieke combinaties van paar-regel genuitdrukking ruimtelijke domeinen langs de anterior-posterior as om elk van de 14 individuele segmenten op te zetten. De 480 BP-versterker die verantwoordelijk is voor het aansturen van de scherpe streep twee van het paarregelgen even-overgeslagen (eve) is goed gekarakteriseerd. De versterker bevat 12 verschillende bindingsplaatsen voor maternale en gap gen transcriptiefactoren. Het activeren en onderdrukken van sites overlappen elkaar in volgorde., Eve wordt alleen uitgedrukt in een smalle streep van cellen die hoge concentraties van de activatoren en lage concentratie van de onderdrukkers voor deze versterker sequentie bevatten. Andere versterker regio ‘ s rijden eve expressie in 6 andere strepen in het embryo.
In gewervelde patroonedit
het vaststellen van de assen van het lichaam is een cruciale stap in de ontwikkeling van dieren. Tijdens de embryonale ontwikkeling van de muis, is de knoop, een transformerende groeifactor-bèta superfamilie ligand, een zeer belangrijk gen betrokken bij het patroon van zowel de anterior-posterior as als de links-right as van het vroege embryo., Het Knooppuntgen bevat twee versterkers: de proximale Epiblastversterker (PEE) en de asymmetrische Versterker (ASE). De plas is stroomopwaarts van het Knooppuntgen en drijft Knooppuntexpressie aan in het gedeelte van de primitieve streep dat zal differentiëren in de knoop (ook wel de primitieve knoop genoemd). De PEE schakelt Knoopuitdrukking in reactie op een combinatie van WNT-signalering plus een tweede, onbekend signaal; zo bindt een lid van de familie van de LEF/TCF-transcriptiefactor zich waarschijnlijk aan een TCF-bindingsplaats in de cellen in de knoop., De verspreiding van knooppunt vanaf de knoop vormt een gradiënt die dan de zich uitstrekkende anterior-posterior as van het embryo patronen. De ASE is een intronische versterker gebonden door de fork head domein transcriptiefactor Fox1. Vroeg in ontwikkeling, fox1-gedreven knooppuntuitdrukking stelt de viscerale endoderm. Later in de ontwikkeling, fox1 binding aan de ASE drijft Knoopuitdrukking aan de linkerkant van het laterale plaat mesoderm, waardoor links-rechts asymmetrie noodzakelijk voor asymmetrische orgaanontwikkeling in het mesoderm.,
het vaststellen van drie kiemlagen tijdens de gastrulatie is een andere kritieke stap in de ontwikkeling van dieren. Elk van de drie kiemlagen heeft unieke patronen van genuitdrukking die hun differentiatie en ontwikkeling bevorderen. De endoderm wordt vroeg in ontwikkeling gespecificeerd door Gata4-expressie, en Gata4 gaat later verder met de directe darmmorfogenese. De Gata4-expressie wordt in het vroege embryo gecontroleerd door een intronische versterker die een andere transcriptiefactor van het forkhead-domein, FoxA2, bindt., Aanvankelijk drijft de versterker brede genuitdrukking door het embryo, maar de uitdrukking wordt snel beperkt tot endoderm, die voorstellen dat andere onderdrukkers in zijn beperking kunnen worden betrokken. Laat in ontwikkeling, dezelfde versterker beperkt expressie aan de weefsels die de maag en alvleesklier zal worden. Een extra versterker is verantwoordelijk voor het handhaven van de Gata4-expressie in het endoderm tijdens de tussenstadia van de darmontwikkeling.,
meerdere versterkers bevorderen de robuustheid van de ontwikkelingdit
sommige genen die betrokken zijn bij kritische ontwikkelingsprocessen bevatten meerdere versterkers met overlappende functie. Secundaire enhancers, of “schaduw enhancers”, kunnen worden gevonden vele kilobases weg van de primaire enhancer (“primaire” verwijst meestal naar de eerste enhancer ontdekt, die vaak dichter bij het gen dat het reguleert). Op zijn eigen, drijft elke versterker bijna identieke patronen van genuitdrukking aan. Zijn de twee versterkers echt overbodig?, Recent werk heeft aangetoond dat meerdere versterkers fruitvliegen in staat stellen om verstoringen in het milieu, zoals een stijging van de temperatuur, te overleven. Wanneer opgeheven bij een opgeheven temperatuur, slaagt één enkele versterker er soms niet in om het volledige patroon van uitdrukking te drijven, terwijl de aanwezigheid van beide versterkers normale genuitdrukking toestaat.