effecten van mutagene agentia op de DNA-sequentie in planten
Achtergrond:
moderne kwekers en landbouwers kunnen een schat aan natuurlijke biodiversiteit exploiteren, die op grote schaal kan worden uitgebreid door toepassing van mutatie-inductietechnieken., De impact van geïnduceerde mutatie op gewasverbetering wordt weerspiegeld in de 2316 officieel geregistreerde rassen (IAEA ‘ s database on officiallyregistred mutant varieties, MVD) die nieuwe geïnduceerde variatie bevatten. Bovendien zijn ongeveer driekwart van deze variëteiten directe mutanten die afkomstig zijn van behandeling met gammastraling, waardoor het belang van fysische mutagenen sterk wordt belicht. Dit alles vertaalt zich in een enorme economische impact op de landbouw en voedselproductie die momenteel wordt gewaardeerd in miljarden dollarsen miljoenen gecultiveerde hectaren (Ahloowalia et al. in voorbereiding.)., Hoewel het agronomische potentieel van geïnduceerde mutatie goed bekend is, zijn de precieze effecten van verschillende mutagenica op de DNA-sequentie in planten nooit beschreven. Voorts hebben de nieuwe omgekeerde genetica en de technologieën van de genontdekking renewedinteresse in veroorzaakte verandering in recente jaren aangemoedigd. Voor deze nieuwe toepassingen is het noodzakelijk de soorten mutaties die door de verschillende klassen mutagenen worden gegenereerd beter te begrijpen en hun frequentie en verspreiding langs het genoom te meten., Vandaag, en voor het eerst, zijn de technologieën op hun plaats om de experimenten te ondernemen die nodig zijn om dit begrip te krijgen.
mutagene agentia kunnen in drie categorieën worden ingedeeld: fysische (bv. gammastralen), chemische (bv. ethylmethaansulfonaat) en transposeerbare elementen (zoals transposons, retrotransposons, T-DNA,retrovirussen). Momenteel zijn slechts beperkte gegevens beschikbaar over de omvang van de op moleculair niveau in planten geïnduceerde genetische effecten en over de specificiteit en de doeltreffendheid van deze verschillende categorieën agentia., Deze gevolgen impliceren DNA-schade, die in veranderingen van het basispaar (enige/eenvoudige nucleotidepolymorfismen,SNPs), kleine inserties en schrappingen (indels) en chromosomale herschikkingen resulteert. Nog minder is bekend over hoe geïnduceerde mutatie interageren met epigenetische processen,zoals methylatie, activering van retro-elementen, en verstoring van hogere orde DNA-structuur.,
hoewel fokkers mutatie-inductie hebben gebruikt om de genetische basis van germplasma te verbreden, en de mutantlijnen rechtstreeks hebben gebruikt als nieuwe variëteiten of als bronnen van nieuwe variatiein kruisveredelingsprogramma ‘ s, was kennis van de precieze aard van de geïnduceerde mutaties niet nodig. Intuïtief werd een conservatief niveau van kleine basispaar herschikking en verwijdering als ideaal beschouwd. Tegenwoordig, heeft het gebruik van veranderingstechnieken buiten toepassingen in het kweken aan genontdekking en omgekeerde genetica uitgebreid., Deze nieuwe toepassingen met hoge productie vereisen specifieke klassen van mutaties die met een hoog rendement over gehele gewas planten genomen worden geïnduceerd, en bijgevolg wordt kennis van de precieze aard van geïnduceerde mutatie een probleem.
High-throughput gen discovery methoden zijn sterk afhankelijk van insertionele ‘knockout’ lijnen, de nu klassieke ‘gen machines’, en deletie ‘knockout’ bibliotheken. Insertionele mutagenesisin impliceert het veroorzaken van verhoogde activiteit van de transpositie van bekende transposeerbare elementen (bijv., retrotransposons die de neiging hebben om in actieve genen om te zetten) om reeksen linesines te produceren die, in theorie, elk gen in het genoom zal zijn geïnactiveerd door de transposon insertie. Deze lijnen kunnen worden gebruikt om genen te identificeren die bepaalde fenotypen veroorzaken of,omgekeerd, kunnen worden gebruikt om genfunctie te identificeren door te zoeken naar een fenotype geassocieerd met de inactivering van een bepaald bekend gen. Echter, insertionele mutanten hebben een neiging om instabiel (dat wil zeggen excisie van de transposon tag, bijv., Ac / Ds binaire systeem,in de volgende generatie kan ervoor zorgen dat het fenotype om terug te keren naar het oorspronkelijke oudertype, of activering van retrotransposon tags door verschillende spanningen kan vermenigvuldigen insertie gebeurtenissen, bijvoorbeeld tijdens micropropagatie). In vergelijking met insertionele mutagenese biedt conventionele mutatie-inductie (d.w.z. met behulp van fysische of chemische agentia) het voordeel van stabiele mutaties.
in theorie houdt de productie van verwijderingsbibliotheken in dat in elk van een reeks regels matig grote verwijderingen worden veroorzaakt, idealiter van 1 tot 100 kb groot.,Deze schrappingen zouden segmenten van elk gen in het genetische repertoire moeten omvatten en zouden minstens door één lijn in de schrappingbibliotheek moeten worden vertegenwoordigd. Deze deletielijnen kunnen, wanneer gebruikt samen met hele genoom genarrays, worden gebruikt om genen te identificeren die verantwoordelijk zijn voor bepaalde fenotypen of om de associatie van bekende genen met bepaalde fenotypen te bevestigen.een nieuwe en belangrijke reverse genetics benadering is ‘targeting induced local laesies in genomes’ (TILLING)., Hier worden grote aantallen kleine veranderingen, of DNA-basenpaarsubstituties of kleine schrappingen die niet meer dan een paar basenparen overspannen, in een reeks lijnen veroorzaakt. In deze lijnen kan de genfunctie worden vastgesteld door een fenotype te associëren met veranderingen in een bepaald gen en kunnen nieuwe allelen van bekende genen worden gegenereerd.
de komende jaren zullen dergelijke nieuwe technologieën een steeds grotere impact hebben op de praktische plantenveredeling. Nochtans, zullen zij verschillende types van veranderingen vereisen die op specifiekfrequencies worden geïnduceerd., Om het mutatieproces op maat te maken, zal er een behoefte zijn om te begrijpen hoe specifieke klassen van mutaties worden gegenereerd en verdeeld over genomen. In het verleden was dit niet mogelijk vanwege een gebrek aan analytische instrumenten en een ontoereikende kennis van zowel het proces van DNA-schade als de architectuur van plantengenomen. Bovendien werd slechts een beperkt aantal plantengenen gesequenced. Vandaag, verstrekken hoog-productiedna het rangschikken methodes aan bio-informatica en functionele genomic benaderingen wordt gekoppeld uitgebreide kennis van genoomarchitectuur., De volledige genomische DNA-sequentie van een model dicotyledonous plant, Arabidopsis, en een model monocotyledon, rijst is onlangs beschikbaar gekomen. Ook wetenschapsmensen vinden zich nu met een reeks methodes, meestal ontwikkeld als moleculaire teller technologieën die kunnen worden aangepast om veranderingen in de opeenvolging van DNA te kwantificeren. Al met al, de stand is ingesteld om de wetenschap van DNA schade veroorzaakt door fysische en chemische mutagenen van menselijke genetica naar plantensystemen over te brengen., Een reeks technologieën kan nu worden gebruikt om zowel het onderliggende basistarief, over aantallen generaties, van spontane mutatie als de momentane effecten van mutatieagenten te kwantificeren. Zo bevinden wetenschappers zich nu eindelijk in de positie om experimenten uit te voeren die de soorten mutaties veroorzaakt door verschillende mutagenen kunnen ontrafelen, zodat toekomstige gebruikers van geïnduceerde mutatie de technologie kunnen gebruiken in een volledig geïnformeerde scanner.,
doelstellingen:
Het doel is inzicht te krijgen in het mechanisme van mutatie-inductie in planten en de typen (basispaarwisselingen of verwijderingen), frequenties (veranderingspercentages ten opzichte van de dosis mutagenen) en patronen (inductie van veranderingen in verschillende delen van het genoom) van veranderingen in DN veroorzaakt door een reeks fysische en chemische mutagenen in een reeks belangrijke plantensoorten te kwantificeren. Moleculaire marker, DNA array, en nieuwe reverse genetische methodologieën zullen worden gebruikt in een unieke benadering om de inductie van mutaties te analyseren en te onderzoeken in een aantal planten van agronomisch belang., Deze resultaten zullen worden gebruikt om protocollen en richtlijnen te verschaffen die belangrijk zijn voor toekomstig gebruik van geïnduceerde mutatie in plantenbiologie en gewasverbetering. De verkregen kennis zal de lidstaten helpen bij het verbeteren van de teeltprogramma ‘ s door middel van gerichte geïnduceerde mutatie en complementaire genomische benaderingen met als doel de duurzaamheid van de landbouw, de voedselzekerheid en de economische stabiliteit te vergroten. Dit CRP zal nieuwe ontwikkelingen in DNA-analyse en genomica benutten om typen, frequenties, snelheden en patronen van mutatie te definiëren die door de verschillende mutagenen worden veroorzaakt., Dit zal een kennisbasis genereren die toekomstige gebruikers van geïnduceerde mutatietechnologieën voor gewasverbetering en genomica zal begeleiden en assisteren.Verder zal het zich richten op fysische mutagenen, zoals gamma-en snelle neutronen-of röntgenstraling. Geselecteerde chemische mutagenen zullen ook worden gebruikt om de relatieve efficiëntie van beide typen mutagene agentia te vergelijken. De effecten van deze mutagenen zullen geëvalueerd worden op genetisch homogeen zaad en vegetatief gekweekt plantaardig materiaal.,Specifieke belangrijke doelstellingen zijn:
- het bepalen van mechanismen en totale niveaus van DNA – schade bij de M1-generatie, bijvoorbeeld rechtstreeks in behandeld zaad in pre-en postkiemingsproeven.
- bepalen van typen, frequenties, snelheden en patronen van mutaties in M2 generaties, over (a) hele genomen en (b) in gerichte DNA-sequenties binnen genomen.
- bepaling van het type en de snelheid van spontane mutatie over generaties in belangrijke plantaardige groepen (bijvoorbeeld een select plantsysteem, om de spontane mutatie te bepalen als basislijn en als een inherente indicator van genotype Mutageniteit).,
- opstellen van protocollen en richtlijnen voor het gebruik van specifieke mutagenen voor een reeks specifieke toepassingen bij gewasverbetering en genomica.
- bepaling van de chemische en moleculaire basis voor differentiële Stralingsgevoeligheid in verschillende variëteiten van dezelfde gewassoort.
- kwantificeren van het type en de snelheid van spontane mutatie bij aanvang, met behulp van multi-generation mutation accumulation experiments.
deelnemers:
download pdf]
Projectmedewerker:
P. J. L. Lagoda