Wat is RNA-seq?
RNA-seq (RNA-sequencing) is een techniek die de hoeveelheid en de opeenvolgingen van RNA in een steekproef kan onderzoeken gebruikend next generation sequencing (NGS). Het analyseert het transcriptoom van genexpressiepatronen gecodeerd binnen ons RNA. Hier, bekijken wij waarom RNA-seq nuttig is, hoe de techniek, en het basisprotocol werkt dat algemeen today1 wordt gebruikt.
Wat zijn de toepassingen van RNA-seq?,
RNA-seq laat ons het transcriptoom onderzoeken en ontdekken, de totale cellulaire inhoud van RNAs met inbegrip van mRNA, rRNA en tRNA. Het begrijpen van transcriptome is sleutel als wij de informatie over ons genoom met zijn functionele eiwituitdrukking moeten verbinden. RNA-seq kan ons vertellen welke genen in een cel worden aangezet, wat hun niveau van uitdrukking is, en op welke tijden zij worden geactiveerd of uitgeschakeld 2. Dit staat wetenschappers toe om de biologie van een cel dieper te begrijpen en veranderingen te beoordelen die op ziekte kunnen wijzen., Enkele van de populairste technieken die RNA-seq gebruiken zijn transcriptional het profileren, SNP identificatie, het uitgeven van RNA en de differentiële analyse van de genuitdrukking 3.dit kan onderzoekers essentiële informatie geven over de functie van genen. Bijvoorbeeld, kan transcriptome alle weefsels benadrukken waarin een gen van onbekende functie wordt uitgedrukt, die zou kunnen aangeven wat zijn rol is. Het vangt ook informatie over alternatieve splicing gebeurtenissen (figuur 1), die verschillende transcripten van één enkele genopeenvolging produceren. Deze gebeurtenissen zouden niet worden opgepikt door het rangschikken van DNA., Het kan ook post-transcriptional wijzigingen identificeren die tijdens mRNA verwerking zoals polyadenylation en 5′ capping2 voorkomen.
figuur 1: gebruik van RNA-seq gegevens maakt gebruik van korte reads van mRNA die vrij is van intronisch niet-coderend DNA. Deze leest moeten dan terug aan het verwijzingsgenoom worden afgestemd.
Hoe werkt RNA-seq?de vroege technieken van RNA-seq gebruikten sanger die technologie rangschikken, een techniek die hoewel innovatief op het ogenblik, ook laag-productie, kostbaar, en onnauwkeurig was., Het is slechts onlangs, met de komst en de proliferatie van NGS technologie, zijn wij in staat geweest om potentieel van RNA-seq volledig te profiteren 4.
De eerste stap in de techniek omvat het omzetten van de populatie van RNA die moet worden gerangschikt in cDNA-fragmenten (een cDNA-bibliotheek). Dit staat RNA toe om in een NGS workflow worden gezet. Adapters worden dan toegevoegd aan elk uiteinde van de fragmenten. Deze adapters bevatten functionele elementen die het rangschikken toelaten; bijvoorbeeld, het versterkingselement en de primaire rangschikkende plaats., De cDNA-bibliotheek wordt dan geanalyseerd door NGS, veroorzakend korte opeenvolgingen die aan of één of beide einden van het fragment corresponderen. De diepte waarop de bibliotheek wordt gesequenced varieert afhankelijk van technieken waarvoor de outputgegevens zullen worden gebruikt. Het rangschikken volgt vaak of single-read of paired-end het rangschikken methodes. Het enig-gelezen rangschikken is een goedkopere en snellere techniek (voor verwijzing, ongeveer 1% van de kosten van het rangschikken van Sanger) die cDNA van enkel één eind rangschikken, terwijl in paren gerangschikt-eind methodenopeenvolging van beide einden, en daarom duurder en tijd-consuming5,6 zijn.,
er moet nog een keuze worden gemaakt tussen strandspecifieke en non-strandspecifieke protocollen. De eerste methode betekent de informatie waarover de bundel van DNA werd getranscribeerd wordt behouden. De waarde van extra informatie verkregen uit strand-specifieke protocollen maken ze de gunstige optie.
Deze reads, waarvan er vele miljoenen zullen zijn tegen het einde van de workflow, kunnen dan worden uitgelijnd op een genoom van referentie en worden geassembleerd om een RNA-sequentiekaart te produceren die het transcriptome7 overspant.,
RNA-seq vs microarrays: waarom RNA-seq als superieur wordt beschouwd
RNA-seq wordt algemeen beschouwd als superieur aan andere technologieën, zoals microarray hybridisatie. Er zijn verschillende redenen voor de status van RNA-seq
een RNA-seq protocolExperiment Planning
voorbereiding voorafgaand aan het starten van uw RNA-seq experiment is essentieel. Vragen die beantwoord moeten worden voordat u begint zijn 10:
•welke methode van RNA-zuivering gebruikt u?
* hoeveel reads heeft u nodig?
* welk platform gaat u gebruiken?,
* welk referentiegenoom gaat u gebruiken?
* Hoe beoordeelt u de kwaliteit van uw RNA?
•moet u uw target RNA verrijken?
•wilt u uw RNA barcoderen?
* heb ik genoeg biologische en technische replicaten?
•sequencing met enkelvoudig lezen of gepaarde eindsequentie?
Voorbereiding cDNA bibliotheek
nadat deze punten zijn overwogen, kunt u beginnen met het voorbereiden van uw cDNA bibliotheek. Dit vereist het toevoegen van de platform-specifieke “adaptersequenties” en versterking van DNA, maar de exacte procedure zal zeer specifiek zijn voor het platform dat in dit stadium wordt gebruikt., De versterking van DNA impliceert een omgekeerde transcriptase gemedieerde eerste bundelsynthese gevolgd door een polymerase-gemedieerde tweede bundelsynthese van DNA10,11.
cDNA Sequencing
zodra de bibliotheek is voorbereid en adapters zijn toegevoegd, kunt u het door u gekozen sequencingplatform gebruiken om uw cDNA-bibliotheek op de gewenste diepte te sequencen. Zodra uw transcript-gegevens zijn geproduceerd, kunt u de gegevens in kaart brengen naar uw referentie-genoom., Het uitlijningsproces kan door de aanwezigheid van lasvarianten en wijzigingen worden gecompliceerd, en de keuze van het gebruikte verwijzingsgenoom zal ook variëren hoe moeilijk dit stadium is. Softwarepakketten zoals STAR zijn in dit stadium nuttig, evenals tools voor kwaliteitscontrole zoals Picard of Qualimap12.
RNA-Seq Data analyse
na de uitlijningsfase kunt u zich concentreren op het analyseren van uw gegevens. Tools zoals Sailfish, RSEM en BitSeq12 zullen u helpen uw expressieniveaus te kwantificeren, terwijl tools zoals MISO, die alternatief gesplitste genen kwantificeert, beschikbaar zijn voor meer gespecialiseerde analyse13., Er is een bibliotheek van deze tools die er zijn, en het lezen van beoordelingen en razzia ‘ s zijn uw beste manier om de juiste tool voor uw onderzoek te vinden.
om samen te vatten, is modern-dag RNA-seq goed gevestigd als de superieure optie aan microarrays en zal waarschijnlijk voorlopig de voorkeursoptie blijven.
5.https://systemsbiology.columbia.edu/genome-sequencing-defining-your-experiment
6.https://emea.illumina.com/science/technology/next-generation-sequencing/paired-end-vs-single-read-sequencing.html
9.https://cofactorgenomics.com/advantages-rna-seq-over-microarray-technology/
10.http://bioinformatics.ucdavis.edu/docs/2015-june-workshop/_downloads/Th_MB_RNASeq_Intro.pdf
11.https://rnaseq.uoregon.edu/#library-prep-stranded-libraries