Dieren
alle experimenten werden uitgevoerd met mannelijke en vrouwelijke C57 / B6-muizen (2-3 maanden oud) die geen fokker waren. Elk geslacht droeg bij aan ongeveer de helft van het totale aantal dieren in elk experiment. Dieren werden gehuisvest in een 12/12 uur donker / licht cyclus en hadden onbeperkte toegang tot voedsel en water., Het gebruik van muizen in deze experimenten was in overeenstemming met De Gids Voor de zorg en het gebruik van proefdieren en experimentele protocollen werden goedgekeurd door de University of Southern California Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
blootstelling aan licht
ogen werden verwijd met 0,5% Tropicamide oftalmische oplossing, USP (AKORN) en 2,5% fenylefrinehydrochloride oftalmische oplossing, USP (AKORN). De muizen waren ‘ s nachts donker aangepast., Ze werden gedurende 30 minuten tot 1 uur in het donker gehouden of blootgesteld aan een diffuus koelwit tl-licht bij een luminescentieniveau van 5000 lux voordat ze werden geëuthanaseerd. De voor beide methoden aangepaste monsters werden in een donkere kamer onder infrarood licht bereid en alle procedures met aangepast weefsel werden uitgevoerd met behulp van een ontleedmicroscoop met infraroodomvormers (B. E. Meyers & Co, Inc.). De aan licht blootgestelde monsters werden onder een dissectiedoek in kamerlicht verwerkt.,
Netvliesdissectie
muizen werden geëuthanaseerd door isofluraaninhalatie gevolgd door cervicale dislocatie. De ogen waren enuclei en de netvliezen werden geïsoleerd in een petrischaal van 35 × 10 mm gevuld met de geschikte buffer/oplossing die hieronder wordt beschreven. Het hoornvlies, de lens en het glasvocht werden van elk oog verwijderd en het gepigmenteerde retinale epitheel (RPE) en sclera werden zorgvuldig van elk netvlies verwijderd. De geïsoleerde netvliezen werden met een veerschalpel in een schaal van 60 × 15 mm gesneden en de randen werden bijgesneden om twee rechthoeken te creëren., Het minimaliseren van de kromming van elk gehalveerd netvlies geholpen bij het afvlakken van het netvlies en zorgde voor een nauwkeurige schil van retinale lagen. Een goede trimming van de vouwranden van het netvlies is essentieel: als het netvlies vouwranden heeft wanneer het op het filtreerpapier wordt geplaatst, zal dit resulteren in een verminderde opbrengst van geïsoleerde ROS en nog belangrijker zal worden verontreinigd met andere retinale lagen.
Immunocytochemie
vóór enucleatie werd de bovenste pool van het hoornvlies gemarkeerd door cauterisatie en vervolgens werden het hoornvlies, de lens en het glasvocht verwijderd., De resterende oogbekers werden gedurende 15 minuten in 4% paraformaldehyde in PBS geplaatst en gedurende 10 minuten 3 keer in PBS gespoeld. De oogcups werden gedurende 2 uur cryoprotected in 30% sucrose in PBS, geplaatst in tissue-Teck® O. C. T.-verbinding (Sakura Finetek, USA) en snel ingevroren in vloeibare N2. De bevroren blokken werden op 10 µm in een cryostaat (cm 3050 S, Leica Microsystems) verdeeld en opgeslagen in -80 °C. voorafgaand aan antilichaamincubatie werden de secties 15 minuten op kamertemperatuur (RT) gebracht., Voor GNAT1-kleuring met behulp van het monoklonaal antilichaam van TF-15 muizen werd epitope-retrieval uitgevoerd: secties werden gedurende 2 minuten RT behandeld met 0,02 mg/ml proteïnase K in blokkerende buffer (2% runderserumalbumine, 2% geitenserum, 0,3% Triton X-100 in 1X PBS) en verhit tot 65 °C gedurende 10 s gevolgd door vijf spoelingen met PBS. Vervolgens werd de blokkeringsbuffer gedurende 1 uur op alle secties aangebracht. de secties werden geïncubeerd met het konijnenantilichaam tegen ARR1 (c10c10 verdund met 1:100 in blokkeringsbuffer) of TF-15 (CytoSignal, verdund met 1:200 in blokkeringsbuffer)., De secties werden gespoeld en geïncubeerd met een fluoresceïne-gelabeld secundair antilichaam (Vectorlaboratoria). Alle secties werden vervolgens dubbel gekleurd met het gebiotinyleerde antilichaam tegen rhodopsine (1D4 verdund 1:300 in blokkeringsbuffer). De secties werden gespoeld en geïncubeerd met rhodamine Avidin D (1:100, Vectorlaboratoria). De beelden werden verkregen met behulp van een Zeiss AxioPlan2 microscoop. Lichte en donkere omstandigheden werden afgebeeld met behulp van identieke belichtingstijden.,
Ros-verzameling door sequentiële peeling met filterpapier
De filterpapierpeelingmethode werd aangepast aan een techniek om fluorescerend geëtiketteerde bipolaire cellen in een platte retinale houder bloot te leggen voor patch clamp-opnames . Het wegpellen van de meerdere lagen van de fotoreceptorcel met filterpapier onthult geleidelijk de bipolaire celdendrieten en cellichamen voor gemakkelijkere toegang voor elektrische stimulatie en flard clamp metingen. We ontdekten dat de gepelde bijproducten, de fotoreceptorlagen die op het filtreerpapier zijn geplakt, vatbaar waren voor latere Western blot analyses.,
Ames ‘ medium werd gebruikt voor de manipulatie van levend netvliesweefsel (Sigma-Aldrich A1420). Twee verschillende buffers werden bereid: Ames-HEPES (aan 1 l voeg 2,38 g HEPES, 0,877 g NaCl, pH 7,4 toe) en Ames-bicarbonaat (aan 1 l voeg 1,9 g NaHCO3, pH 7,4 toe). Beide werden van tevoren bereid, steriel gefilterd en bewaard bij 4 °C. alle procedures werden uitgevoerd bij RT., Voorafgaand aan de netvliesdissectie werd 50-100 mL Ames-HEPES borreld met 100% O2 in een GibcoTM 100 mL mediafles (Thermo Fisher, USA) en werd 50-100 mL Ames-bicarbonaat borreld met 95% O2 en 5% CO2 in een lichtdichte container gedurende 15-20 minuten voor gebruik.
netvliezen werden bereid zoals beschreven in de sectie ‘netvliesdissectie’en opgeslagen in een lichtdichte container met Ames-bicarbonaat borreld met 95% O2 en 5% CO2 om de fysiologische pH te behouden., Deze incubatievoorwaarde is identiek aan die door netvliesfysiologen voor ex vivo electroretinogramopnamen of aanzuigelektrodeopnamen wordt gebruikt, en kan weefsellevensvatbaarheid en functionaliteit verscheidene uren handhaven. Voor elke peelingprocedure werd een gehalveerd stuk rechthoekig getrimd netvlies gebruikt. Het weefsel werd overgebracht via een 1,7 mL plastic pipet (tip gesneden) in een 35 × 10 mm petrischaal met zuurstofhoudende Ames’-HEPES. De media werd elke 10 minuten ververst tijdens het peelingproces om de zuurstofhoudende toestand te behouden., De retina in oplossing werd met de fotoreceptorzijde naar beneden gericht met behulp van een pincet en de transferpipet. In de petrischaal naast het netvlies werd een rechthoekig stuk filtreerpapier van 5 mm × 2,5 mm uit VWR-klasse 413 gesneden filtreerpapier (diameter 5,5 cm, poriegrootte 5 µm, VWR, USA) geplaatst. Het netvlies werd voorzichtig met een pincet (lichtjes de randen vasthouden) op het filtreerpapier geschoven met de fotoreceptorzijde naar beneden. Zodra het netvlies was gecentreerd op het filtreerpapier, werden beide voorzichtig uit de Ames’HEPES getild., De onderkant van het filtreerpapier (de zijkant zonder het netvlies) werd op een papieren handdoek gestippeld om de vloeistof op het filtreerpapier op te nemen (2-3 dabs). Dit creëerde een veilige hechting tussen de fotoreceptorcellen en de vezels van het filtreerpapier, en deze hechting was belangrijk voor het verwijderen van de Ros-laag. Een druppel Ames ‘ – HEPES van de petrischaal werd op het netvlies geplaatst, en het filtreerpapier werd weer op de papieren handdoek gevlokt. Dit werd in totaal drie keer herhaald., Het filtreerpapier met het netvlies werd vervolgens terug in de petrischaal geplaatst en ondergedompeld, en het weefsel verwijderd uit het filtreerpapier met een pincet. Er werd op gelet om alleen de uiterste omtrek van het netvlies aan te raken om de structurele integriteit van het netvlies te behouden. Om het schilproces te vergemakkelijken, werden de randen van het netvlies voorzichtig van het filtreerpapier verwijderd aan elke kant, waardoor de hechting van het netvlies aan het filtreerpapier losser werd., Nadat het netvlies van het filtreerpapier was verwijderd, werd het onderoppervlak van het filtreerpapier op een papieren handdoek gevlokt en in een buis met het label +ROS geplaatst en op ijs bewaard. Het hierboven beschreven peelingproces werd ongeveer 7-8 keer herhaald. Na 5 schillen werd het netvlies dunner, transparanter en was gevoelig voor scheuren. Na het schillen werd de + ROS-buis met het verzamelde filterpapier en de resterende gepelde gehalveerde retina in de-ROS-buis geplaatst, ingevroren op droogijs en opgeslagen bij -80 °C.,
scheiding van fotoreceptorcompartimenten door peeling van gelyofiliseerd netvlies
Deze methode is aangepast aan de methode die is beschreven door M. E. Guido, et al. , die ontwierp een ScotchTM tape peeling methode die gevriesdroogde kuiken netvlies gebruikt om selectief scheiden van het netvlies in verschillende lagen (photoreceptor cellen, binnenste nucleaire laag, en ganglion cellen)., Aangezien netvlies van verschillende diermodellen verschillende staaf – en kegeldistributies hebben en asymmetrisch met tape kunnen scheiden na lyofilisatie, pasten we deze methode aan en verkenden we het nut ervan voor de scheiding van staafcompartimenten van muizen netvlies.
vriesdrogen van geïsoleerde netvliezen
netvliezen werden bereid zoals beschreven in de sectie ‘netvliesdissectie’. Bij de dissectie werd gebruik gemaakt van koudwalsen (130 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 2,4 mM MgCl2, 1,2 mM CaCl2, 10 mM HEPES, 0,02 mM EDTA, pH 7,4). Andere fysiologische buffers, zoals Ames’-HEPES, kunnen ook worden gebruikt., Omdat meerdere monsters vaak tegelijkertijd werden behandeld, werden de 5 × 2,5 mm filterpapierstukken (Whatman ® Grade 1 kwalitatief filterpapier (diameter 9 cm, poriegrootte 11 µm, GE Healthcare, USA)) van tevoren geëtiketteerd voordat ze in een petrischaal werden geplaatst die gevuld was met koude Ringer ‘ s buffer. Voor elk monster werd een gehalveerd, rechthoekig stuk retina op het filtreerpapier gepositioneerd met behulp van een 1,7 mL transferpipet (snijdpunt) met de zijde van de ganglioncel naar beneden en de buitenzijde van het fotoreceptorsegment naar boven., Zodra het weefsel was gecentreerd op het filtreerpapier, beide werden opgetild uit de buffer van de Ringer en de bodem van het filtreerpapier (de zijkant zonder het netvlies op het) werd gevlokt op een papieren handdoek (2-3 dabs) om de bevestiging van de ganglion cel laag op het filtreerpapier te vergemakkelijken. Een druppel cold Ringer ‘ s werd geplaatst op het netvlies, en de filterpapierbodem werd opnieuw gevlokt op de papieren handdoek. Dit werd in totaal drie keer herhaald. Ringer ’s buffer werd verwisseld voor nieuwe Koude Ringer’ s buffer na elke monstervoorbereiding., Het filtreerpapier met bijgevoegd netvlies werd in een met koude Ringer ‘ s gevuld petrischaaltje geplaatst totdat alle monsters op dezelfde manier werden verwerkt. Ten slotte werden ze weer uit de oplossing gehaald, de bodem van het filtreerpapier droog gevlokt en een druppel koude PBS op het filtreerpapier naast het netvlies geplaatst, de bodem van het filter opnieuw gevlokt en in een schone en droge petrischaal van 35 × 10 mm geplaatst. Het doel van deze stap was om de meer complexe Ringer ‘ s af te spoelen met PBS om de hoeveelheid gedroogd zout op het gevriesdroogde weefsel te verminderen., Nadat alle weefselmonsters met deze laatste spoelstap waren verwerkt en in de schone petrischaal waren verzameld, werd de schaal lichtdicht verpakt met twee lagen 2,5 × 2,5 inch vierkante stukjes aluminiumfolie, met kleine gaatjes, zodat de donker aangepaste retina-monsters niet aan licht worden blootgesteld en snel worden ingevroren in vloeibaar N2. Door de kleine gaatjes kwam vloeistof N2 in het interieur, waardoor de petrischaal werd gevuld, en werd ervoor gezorgd dat de gaatjes werden verschoven zodat de petrischaal lichtdicht werd verpakt., De petrischaal werd vervolgens gedurende 30 minuten in een Labconco-kolf van 600 mL met behulp van een VirTis Benchtop 2 K Lyophilizer (Sp Scientific, USA) geplaatst om het weefsel te lyofiliseren.
Peeling van retinale lagen met ScotchTM tape
gevriesdroogd retinale weefsel werd opgeslagen bij -80 °C in een drogeritetm (W. A. Hammond Drierite Co, USA) gevulde container of werd geïsoleerd als +ROS, +RIS, en-ROS / RIS-depletie Weefsel (- OIS), opnieuw ingevroren zoals hierboven beschreven of verwerkt voor Western blots op dezelfde dag. Alle peeling procedures werden uitgevoerd onder kamer licht. Strips kleiner dan 2.,5 mm in breedte werden gesneden en geplaatst op de rand van de tape dispenser tot bijgesneden in rechthoekige stukken. Een gevriesdroogd netvlies bevestigd aan Whatman ® filterpapier werd in een schone 10 cm petrischaal geplaatst. Een klein rechthoekig stukje ScotchTM-tape (iets groter dan het oppervlak van het weefsel) werd gesneden en zorgvuldig bovenop het gevriesdroogde netvlies gelegd. Het plaatsen van de tape op de top van het gevriesdroogde netvlies was bijna voldoende om de oranje-getinte Ros laag te bevestigen aan de tape., Om volledig contact van de ROS met de tape te garanderen, werd met een pincet lichte druk uitgeoefend op de bovenkant van de tape om contact met het bovenoppervlak te verzekeren. Na het voorzichtig wegpellen van de tape, werd de oranje-getinte Ros laag gehecht aan de tape en gescheiden van de rest van het netvlies. Deze fractie werd gelabeld + ROS en geplaatst in een schone microdumper. Vaak was een dunne, witte film zichtbaar op het gebroken oppervlak van de oranje laag op de eerste tape-schil., Dit oppervlak werd verwijderd door meer tape peels totdat het volledig werd verwijderd en de oranje kleur van de Ros laag werd naar het oppervlak gebracht. Deze witte laag die aanvankelijk aan ROS was bevestigd, werd in een aparte buis geplaatst en gelabeld met +RIS fractie. Tape werd gebruikt om het overgebleven netvlies weefsel uit het filtreerpapier te verwijderen en werd in een buis met label-OIS geplaatst., De hoeveelheid druk toegepast op de tape voor de eerste schil van de oranje getinte Ros laag beïnvloed hoe het gevriesdroogde Monster gefractioneerd; te veel druk veroorzaakt de hele gevriesdroogde retina af te pellen van het filterpapier op de tape en te weinig druk niet de bovenste oranje laag van het netvlies scheiden. Een paar passes over de tape met behulp van minimale druk met een pincet was nuttig bij het voelen van de minimale en maximale hoeveelheid druk toe te voegen aan de bovenkant van de tape.,
monstervoorbereiding voor Western blot: schillen met filtreerpapier
De +ROS-buizen die het filtreerpapier bevatten, werden gedurende 2 s snel in een microcentrifuge gedraaid en de overtollige vloeistof werd verwijderd. Elke buis werd afzonderlijk verwerkt (een gehalveerd netvlies) of twee buizen (twee gehalveerd netvlies) werden gecombineerd voor meer geconcentreerd materiaal. Het + ROS-isolaat in een enkele buis werd gehomogeniseerd in 45-60 µL cold RIPA buffer buffer (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% natriumdeoxycholaat, 0,1% SDS, 1 mM EDTA, 0.,1 M PMSF, complete mini-proteaseremmer (Roche Applied Sciences)), en het-ROS-isolaat in een enkele buis werden gehomogeniseerd in 80-100 µL RIPA-buffer. Wanneer twee buizen werden gecombineerd, 80-110 µL koude RIPA buffer werd gebruikt om +ROS homogeniseren en 100-150 µL koude buffer werd gebruikt voor-ROS. Alle buizen werden gedurende 1 min gehomogeniseerd met een geautoclaveerde stamper. Er werd veel zorg aan besteed om ervoor te zorgen dat de filterpapierstukken in de +Ros buizen aan de zijkant van de buizen werden gehouden en in contact bleven met de stamper in plaats van aan de onderkant vast te zitten., Na homogenisatie werden steriele pincetten gebruikt om de filterpapierstukken naar de zijkant van de +Ros-buis te verplaatsen, gevolgd door 2-4 S spin in de microcentrifuge. Deze spin haalde de vloeistof uit het papier, en de vloeistof werd overgebracht in een schone buis en verwerkt voor Western blot zoals hieronder beschreven. Dit was de meest tijdrovende stap, en indien niet goed uitgevoerd, kan een groot deel van het monster uiteindelijk worden geabsorbeerd door de stukken filtreerpapier. Om het herstel van het monster te maximaliseren, moet de grootte van de filterpapierstukken die voor de schillen worden gebruikt, worden bijgesneden om het gebied van het netvlies Weefsel overeen te komen.,
monstervoorbereiding: schillen met ScotchTM-tape
net als bij de filterschillenmethode werden twee buisjes gecombineerd, die elk een gepelde laag van de helft van het netvlies bevatten, om de eiwitconcentratie te verhogen. +ROS en + RIS monsters werden gehomogeniseerd in 100-115 µL, en-OIS monsters in 125 µL cold RIPA buffer. Alle buizen werden gedurende 1 min gehomogeniseerd. Er werd veel zorg aan besteed om ervoor te zorgen dat de tape in de +ROS -, +RIS-en-OIS-buizen in contact bleef met de stamper en dat de tape aan de zijkant van de buizen werd gehouden in plaats van aan de onderkant vast te zitten., Na homogenisatie werden steriele pincetten gebruikt om stukjes tape naar de zijkant van de buizen te verplaatsen. De buizen werden 2-4 s in de mini centrifuge gesponnen, waarna de gedroogde stukjes tape zorgvuldig werden verwijderd.
Eiwitkwantificatie, gelelektroforese en eiwitimmunobloten
een BCA-eiwitassaykit (Thermo Scientific, USA) werd gebruikt om de totale hoeveelheid eiwit in elk monster te bepalen. Twee microliter DNaseI (10 eenheden/µL, Roche, Zwitserland) werden aan de monsters toegevoegd en werden gedurende 30 minuten op kamertemperatuur gelaten., Aan het homogenaat werd een passend volume van 4x SDS-monsterbuffer (40% glycerol, 240 mM Tris-Base pH 6,8, 8% SDS, 5% ßME, 0,04% Broomfenolblauw) toegevoegd.,tr>
Approximately 10 μg of protein lysate was loaded per lane and separated on a pre-cast polyacrylamide Bis-Tris gel with a 4–12% gradient (Life Technologies, USA) and transferred onto nitrocellulose membrane., De membranen werden geblokkeerd in 10% melk / TBS-t buffer gedurende 1 uur bij RT, en ‘ s nachts geïncubeerd met de volgende antilichamen: anti-ARR1-antilichaam van konijnen (1: 1000, ref), monoklonaal antilichaam van muizen (TF-15, 1:1000, CytoSignal), anti-β-actine-antilichaam van konijnen (1:5000, GeneTex Inc.), konijn anti-RGS9 antilichaam (1: 1000), konijn anti-Gß5L/s (CT215) (1:2000), en konijn anti-cytochroom C polyclonal antilichaam (1:500, Santa Cruz, SC-7159). Membranen werden geïncubeerd met fluorescerend geëtiketteerde secundaire antilichamen (1:10.000, Li-Cor Biowetenschappen) bij RT gedurende 1 uur., De eiwitbanden werden gedetecteerd door het Odyssey® infrarood beeldvormingssysteem (LI-Cor Biosciences, USA) en de fluorescentieintensiteit van individuele banden werd gekwantificeerd met behulp van ImageJ. GNAT1, ARR1 en RGS9 signalen werden genormaliseerd tegen Gß5L voor +ROS, + RIS monsters, en tegen actin voor-ROS en-OIS monsters. Voor elk onafhankelijk experiment, werden de fluorescente signalen voor elke proteã ne in elk compartiment ook genormaliseerd tegen gecombineerde signalen van alle netvlies compartimenten. Ongepaarde 2-tailed t-tests werden gebruikt om verschillen tussen twee groepen te bepalen.