differentiële migratie van holo-en apo – metalloproteïnen door MICS-BN-PAGE
terwijl er geen scheiding van holo-(Fe2 – transferrin (Tf)) en apo-Tf werd waargenomen in conventionele 1D Native (CBB g-250 vrij)-pagina (vijg. 1a) en SDS-PAGE (Fig., 1b), interessant, vonden we dat holo-en apo-Tf zijn volledig gescheiden door middel van MICS-BN-PAGE (Fig. 1c) (opgemerkt moet worden dat twee banden werden waargenomen voor een “zuiver” apo-Tf-monster met behulp van BN-PAGE zonder MICS-modus als gevolg van metaalionencontaminatie; aanvullende Fig. S1). In SDS-PAGE is dit waarschijnlijk te wijten aan de dissociatie van metaalionen van holovormen14,15 (gegevens niet weergegeven). Dit feit stelt voor dat de elektroforetische erkenning tussen holo-en apo-vormen niet beschikbaar is voor conventionele PAGINAMETHODEN., Deze resultaten impliceren dat specifieke zwakke denaturerende agenten, zoals CBB-g 250 aangewend in MICS-BN-PAGE, het verschil tussen holo – en apo-metalloproteïnen erkennen om de scheiding te verbeteren, naast het vermijden van metaaldissociatie.
verschillende migratiegedrag voor holo-en apo-vormen werden ook waargenomen voor ceruloplasmine (Cp) gebonden met Cu2+ (Cu-Cp) en superoxide dismutase (SOD) gebonden met Cu2+ en Zn2+ (Cu/Zn-SOD) door de MICS-BN-PAGE methode (Fig. 1d, e). Apo-vormen gemigreerd naar posities in nauwe overeenstemming met hun nauwkeurige molecuulgewichten in MICS-BN-PAGE (Fig., 1: TF, 77 kDa; Cp, 134 kDa; SOD, 32 kDa), wat nuttig is bij het identificeren van de eiwitten. Zoals beschreven in de inleiding sectie, Deze bevindingen leidden ons tot de ontwikkeling van de Holo/apo conversie (HAC)-2D MICS-BN-PAGE methodologie voor selectieve isolatie van holo-metalloproteïnen.
Concept van Holo / apo-conversie 2D MICS-BN-PAGE
onze nieuwe 2D – PAGINAMETHODE, gebaseerd op de differentiële migratie tussen holo-en apo-metalloproteïnen, begint met een MICS-BN-PAGE-fase, uitgevoerd in twee rijstroken (rijstroken A en B in Fig., 2, paneel I) om de scheiding van holo – en apo-metalloproteïnen mogelijk te maken uit een monster dat beide metalloproteïnevormen bevat. De twee rijstroken worden vervolgens onderworpen aan twee verschillende behandelingen na de eerste MICS-BN-PAGE scheiding: Baan A wordt onderworpen aan een tweede MICS-BN-PAGE fase, maar alleen na het ondergaan van een holo / apo conversie behandeling (Fig. 2 paneel II-1); terwijl Baan B aan een fase van de METAALDETECTIEPAGINA wordt geleverd om de metaalionen te bepalen die met de gescheiden proteã nen worden geassocieerd (Fig. 2 paneel II-2). De op baan B toegepaste behandeling is eerder gevalideerd., Zo is de bepaling van sommige zware metaalionen (Cu2+, Fe3+, Co3+, Ni2+, Mn2+ en Cd2+) in monsters van kleine hoeveelheden (µL) bij PPT-en sub-ppb-niveaus volgens deze PAGINAMETHODE gerapporteerd zonder gebruik van een cleanroom21. Bovendien onthulde deze tandem 1D MICS-BN-PAGE / metal detection PAGE methodologie de precieze verdeling van Cu2+ in menselijk serum, zelfs voor zwak albumine-gebonden (uitwisselbaar) Cu2+ 21, en suggereerde dat het periplasmische Rubrivivax gelatinosus copi eiwit dat sterk betrokken is bij koperweerstand een koperbindend eiwit22 is., Nog steeds, om metaal-gebonden proteã nen in een complexe eiwitsteekproef volledig te identificeren is moeilijk toe te schrijven aan co-migrerende proteã nen. Het is bijvoorbeeld niet volledig bewezen dat CopI een koperbindend eiwit is in R. gelatinosus, hoewel de sequentie drie mogelijke cu-bindingsplaatsen heeft: (i) een type 1 kopercentrum dat aanwezig is in veel cupredoxinen zoals azurine en plastocyanine, (ii) een Histidine-rijke n-terminussequentie en (iii) een Histidine-/Methionine-rijke sequentie. CopI-verwante proteã nen zijn aanwezig in vele bacteriën maar worden niet wijd behouden; bijvoorbeeld, is het afwezig van Escherichia coli22., Tot nu toe zijn alleen de eiwitten van R. gelatinosus en Vibrio cholerae onderzocht en zijn betrokken bij CU-resistentie 22,23. In R. gelatinosus, wordt het CopI-eiwit hoogst uitgedrukt in aanwezigheid van Cu2+; nochtans, is het cu-ontgiftingsmechanisme nog onbekend. Aldus, is een methode voor isolatie van metalloproteins van alle andere proteã nen die in complexe biologische steekproeven naast elkaar bestaan noodzakelijk.
Concept of HAC-2D MICS-BN-PAGE/metal detection PAGE methodology., Paneel I: 1D MICS-BN-PAGE in twee rijstroken. Baan A werd onderworpen aan de in-gel holo/apo conversieprocedure (zoals in Paneel II-1), en vervolgens Baan A werd onderworpen aan 2D MICS-BN-PAGE na Holo/apo conversie (zoals in Paneel III). Baan B werd onderworpen aan Cu2 + en Fe3+ detectiepagina (zoals in Paneel II-2). Het 2D elektroferogram is voor een mengsel van metalloproteïnen (holo – Tf, apo-Tf, holo-Cp en holo-SOD), waarin holo-metalloproteïnen in het oorspronkelijke monster werden geïsoleerd als vlekken van de diagonale lijn (de gestippelde gele lijn in Paneel III). Volledige versies van elektropherogrammen weergegeven in Fig., 2 zijn afgebeeld in Fig. S2.
om deze beperking te overwinnen, wordt de informatie die wordt verstrekt door de 1D MICS-BN-PAGE/metaaldetectiepagina-analyse van rijstrook B aangevuld door rijstrook a te onderwerpen aan een tweede dimensie van MICS-BN-pagina na Holo / apo-conversie. Om deze analyse uit te voeren, wordt Baan A eerst gedrenkt in een zure, metaalchelatoroplossing (Zie sectie methoden en aanvullend voor de gedetailleerde voorwaarden) voor Holo/apo-conversie (Fig. 2 paneel II-1)., Daarbij worden de holo-metalloproteïnen afgeleid tot metaalvrije apo-metalloproteïnen in de gel van de eerste pagina dimensie. De behandelde rijstrook A wordt vervolgens met behulp van een metaalvrije agarosegel naar de tweede fase van MICS-BN-PAGE gebracht (zie aanvullende informatie). In de tweede MICS-BN-pagina fase (Fig. 2, panel III) migreren apo-metalloproteïnen en niet-metalloproteïnen uit het oorspronkelijke monster op de diagonale lijn, aangezien de migratie van deze soorten in de tweede PAGINADIMENSIE volledig identiek is aan hun migratie in de eerste PAGINADIMENSIE., Aan de andere kant migreren holo-metalloproteïnen uit het oorspronkelijke monster verschillende afstanden in de eerste en tweede MICS-BN-PAGE dimensies, omdat deze eiwitten migreren als hun holo-vormen in de eerste dimensie en als hun apo-vormen in de tweede dimensie (en omdat MICS-BN-PAGE resulteert in een verschillende elektroforetische mobiliteit voor holo – en apo-vormen van metalloproteïnen; vide infra). Aldus, migreren slechts holo-metalloproteïnen van de originele steekproef van de diagonale lijn in de tweede dimensie, door MALDI-TOF lidstaten zonder enige extra eiwitreiniging worden geà dentificeerd., De soorten en hoeveelheden met metalloproteïnen gebonden metaalionen in de oorspronkelijke monsteroplossing (die geïsoleerd zijn als diagonale vlekken) kunnen worden bepaald aan de hand van de metaaldetectiepagina van Baan B, zoals hierboven beschreven. Vandaar dat informatie met betrekking tot de identificatie en distributie van metalloproteïne soorten, samen met de identiteiten en concentraties van metaalionen die ze binden, toegankelijk is vanuit deze nieuwe hac-2D MICS-BN-PAGE/metal detection PAGE methodologie.,
selectieve isolatie van metalloproteïnen in HAC-2D MICS-BN-PAGE
voor proof-of-concept werd hac-2D MICS-BN-PAGE / metaaldetectiepagina aangetoond voor een monstermengsel dat Holo-Tf, apo-Tf, holo-Cp en holo-SOD eiwitstandaarden bevat (resulterend in het 2D elektroferogram in Fig. 2, panel III), alsmede voor een menselijk serummonster (aanvullende Fig. S3). De vlekken van holo-metalloproteins die van de diagonale lijn migreerden werden met succes waargenomen voor de gemengde eiwitsteekproef., Daarnaast werd Fe3+ gedetecteerd op de positie van holo-Tf, en Cu2 + op de posities van holo-Cp en holo-SOD, in de eerste fase van MICS-BN-pagina met behulp van metaaldetectiepagina. Als geen Holo / apo-omzetting wordt uitgevoerd, migreren alle proteã nen op de diagonale lijn (aanvullende Fig. S5). Voor een menselijk serummonster werden holo-Tf en holo-Cp met succes gedetecteerd (aanvullende Fig. S3)., Zo werd geconcludeerd dat HAC-2D MICS-BN-PAGE/metaaldetectiepagina zeer effectief is voor de isolatie van holo-metalloproteïnen en de identificatie van metaalionen die oorspronkelijk aan metalloproteïnen in een eiwitmengsel gebonden waren.
ten slotte werd de HAC-2D MICS-BN-PAGE methode toegepast op een totale bacteriële oplosbare eiwitfractie verkregen uit R. gelatinosuscellen gekweekt in aanwezigheid van 1,2 mM Cu2+, met expressie van CopI-eiwit. Dit vertegenwoordigt een biologische eiwitsteekproef., Voor dit monster werd een vlek van de diagonale lijn gevonden op de positie van 100 kDa en 29 kDa op respectievelijk de eerste en tweede pagina (Fig. 3a). Een hoge concentratie van Cu2+ werd waargenomen op de positie van 97-139 kDa in de eerste MICS-BN-pagina (Fig. 3b). Bijgevolg werd geconcludeerd dat het eiwit op deze plek Cu-ion eraan gebonden heeft. De vlek werd gesneden en vervolgens geanalyseerd door MALDI-TOF MS. Peptides die aan CopI beantwoorden werden geà dentificeerd (Fig. 3c, aanvullende Fig. S7 en tabel S1)., Bovendien, toen deze gelvlek op SDS-pagina werd in werking gesteld, werd één enkele band van CopI proteã ne waargenomen (gegevens niet getoond). Een andere plek van de diagonale lijn werd waargenomen op ongeveer 40 kDa (boven de 29 kDa CopI plek in de tweede dimensie (Fig. 3a)). Het werd bevestigd door MALDI-TOF MS dat deze plek ook afkomstig was van CopI (en waarschijnlijk een dimeer van CopI was volgens het molecuulgewicht). Aldus,zou een metalloproteïne specifiek uit een complex eiwitmengsel kunnen worden geà soleerd terwijl ook het identificeren van zijn gebonden metaal., Deze analyse door HAC-2D MICS-BN-PAGE heeft zeker bewezen dat CopI een koperbindend-eiwit is, en interessant, dat deze eigenschap kan worden gerelateerd aan de Cu-ontgiftende functie van het eiwit in het bacteriële periplasma. Verdere kwantitatieve analyse onthulde de stoichiometrie Van Cu-ion aan CopI als 1:1 (gebaseerd op de concentraties van het gebonden cu-ion (1,05 µM) en van het Holo-CopI-eiwit (0,95 µM) zoals bepaald door CBB R-250 kleuring). Dit is in volledige overeenstemming met andere experimentele resultaten, die een CU:CopI stoichiometrie van 1:1.2 gebruikend ICP-MS met zuivere CopI (Durand et al.,, niet-gepubliceerde gegevens). Dit resultaat suggereert dat onze methode ook nuttig is voor onderzoek naar metalloproteïne stoichiometrie.
hac-2D MICS-BN-PAGE met zilverkleuring (A), met Cu2+ detectiepagina (b), van een oplosbare fractie verkregen uit R. gelatinosuscellen gekweekt in de aanwezigheid van 1,2 mm CU2+ (totaal eiwit: 31,5 µg). De diagonale vlek, aangegeven met de sterretje onder a), is onderworpen aan MALDI-TOF MS (aanvullende Fig., S7), het identificeren van de sequenties weergegeven in rood lettertype als onderdeel van de copi Rijpe sequentie (c). Volledige versies van elektropherogrammen weergegeven in Fig. 3 zijn afgebeeld in aanvullende Fig. S8.
capillaire elektroforese experimenten om moleculaire herkenningsmodi te onderzoeken
De resolutie verbetering tussen holo – en apo-vormen in MICS-pagina ondersteund met CBB kleurstof (Fig., 1c-e) is een belangrijke sleutel tot onze methodologie, en, interessant, schijnt deze moleculaire herkenning uit verschillende aantallen CBB G-250 kleurstofmolecules te komen die aan elk van de holo – Versus apo-vormen van metalloproteins binden. Dit, op zijn beurt, waarschijnlijk resulteert in verschillende effectieve ladingen, en/of geïnduceerde sterische structuren, voor de kleurstof-eiwit complexen. Beide gevolgen zouden elektroforetische mobiliteit beà nvloeden., Om dieper inzicht te krijgen in het herkenningsmechanisme van de CBB G-250 kleurstofbinding naar holo – en apo-Tf, werden CE-experimenten uitgevoerd, samen met docking simulaties met behulp van het autodock Vina program24,25 (vide infra). CZE wordt uitgevoerd in vrije waterige oplossing zonder een gelmatrix, en dus hoeft een moleculair zeefeffect niet te worden overwogen in de simulaties. De elektroforetische mobiliteit van holo-Tf gemeten door CZE was duidelijk verschillend van die van apo-Tf met de toevoeging van de CBB kleurstof (Fig. 4), terwijl deze proteã nen identieke mobiliteit in de afwezigheid van de kleurstof hadden., Dit feit suggereert sterk dat het aantal kleurstofmoleculen die met holo – en apo-metalloproteïnen worden gebonden verschillend is. In CZE, zou de migratie van het eiwit-kleurstofcomplex hoofdzakelijk door de efficiënte last van het complex worden beà nvloed, die, beurtelings, door het aantal afzonderlijk geladen anionic CBB-kleurstofmolecules worden beà nvloed die aan de proteã ne worden gebonden.,
typische elektroferogrammen van CZE – experimenten voor: 10 µM holo-of apo-Tf zonder CBB G-250 (bovenste groene spoor); en mengsels met 5 mM CBB g-250 kleurstof met 10 µm Holo-TF (middenblauw spoor) of met 10 µm APO-tf (onderste rode spoor).,
Traditiegetrouw de elektroforetische mobiliteit van een eiwit in oplossing wordt vertegenwoordigd door de Henry vergelijking, zoals weergegeven in vergelijking (1):
Hier, Q, η, R en k zijn, vertegenwoordigen de netto kosten, de oplossing viscositeit, de straal van het eiwit, en de inverse Debye lengte van elektrolyt oplossing. De Henry-functie, H, neemt eentonig toe van 2/3 naar 1., Strikt genomen is deze formule uitsluitend van toepassing op een sferische molecule met een centrosymmetrische ladingsdistributie, hoewel er enkele discussies zijn om de Henry-vergelijking aan te passen aan niet-sferische proteã nen met complexe ladingsdistributie (met inbegrip van dipool en quadrupole)26. In ons geval zijn Holo-en apo-Tf-moleculen vervormde bollen van zeer vergelijkbare grootte (die lijken op bolletjes met lange en korte aslengten van ongeveer 92 en 60 Å (holo-Tf), en 93 en 68 Å (apo-Tf), respectievelijk) (aanvullende Fig. S9)., Bovendien, worden de dipool en quadrupol geacht slechts een gering effect op mobiliteit te hebben aangezien de molecules van CBB G-250 die aan holo-/apo-Tf worden gebonden niet gelokaliseerd, zoals in aanvullend Fig. S9 (zie hieronder). De resultaten van nauwkeurige berekeningen door Kim et al.Laat zien dat de elektroforetische mobiliteit van een sferoïdaal eiwit niet significant wordt beïnvloed door een quadrupol in oplossingen met een lage ionische sterkte (I < 0,01 M), en de Ionische sterkte van de scheidingsbuffer in onze CZE experimenten was vergelijkbaar laag (I = 0,013 M).,
De verhouding tussen de elektroforetische mobiliteit van apo – en holo-Tf gecomplexeerd met CBB G-250 kleurstof (namelijk µApo/µHolo) wordt dus toegeschreven aan de verhouding tussen de netto ladingen van elk complex (namelijk QApo/QHolo), die gemakkelijk kan worden afgeleid uit de Henry-vergelijking. De negatieve netto ladingen van TF-CBB g-250 complexen komen voornamelijk voort uit het bindingsgetal van de kleurstof. Bijgevolg geeft de waarde van µApo/µHolo ook de verhouding van de kleurstofnummers weer (namelijk NApo/NHolo). Experimenteel, de verhouding van elektroforetische mobiliteit van de twee vormen van Tf (µApo/µHolo = (-2.69 × 10-4)/(-2.,09 × 10-4)) bleek 1,29 te zijn door CZE (Fig. 4), die overeenkomt met de verhouding van effectieve elektrische lading, mits de afmetingen van beide vormen van Tf zijn vergelijkbaar. Vandaar, zou de verhouding van elektroforetische mobiliteit met de verhouding van gebonden kleurstofmolecules moeten overeenkomen. Nochtans, is de verdere bespreking van het verband tussen elektroforetische mobiliteit en eiwitvorm voor andere metalloproteins nodig in gevallen wanneer holo – en apo-eiwitvormen verschillen (zoals voor Cp).,
moleculaire docking simulatie experimenten om moleculaire herkenningsmodi te onderzoeken
Kleurstofbinding werd bepaald door flexibele moleculaire docking simulaties door AutoDock Vina27, ontworpen om uitputtend te zoeken naar bindingsplaatsen en hun vrije energieën te berekenen (Fig. 5 en aanvullende Fig. S9). Onlangs, Wang et al.25 rapporteerde dat AutoDock Vina een hoog scorend vermogen en een gemiddeld bemonsteringsvermogen heeft ten opzichte van andere veelgebruikte docking programma ‘ s., Volgens deze simulaties, grotere aantallen CBB G-250 kleurstofmoleculen gebonden aan vacante Fe-bindende plaatsen in apo-Tf in vergelijking met holo-Tf (Fig. 5a) werden waargenomen. Op basis van deze autodock Vina-simulaties bleek de verhouding van het kleurstofbindingsgetal NApo/NHolo 1,23 te zijn, met een bindingsenergie <-6,5 kcal/mol (overeenkomend met K~104,4 M−1) (Fig. 5b voor het kleurstofbindingsgetal cumulatieve frequentieverdeling als functie van bindingsenergie), wat in goede overeenstemming is met onze eerder besproken CZE-resultaten (NApo/NHolo = 1,29)., Kwantitatieve binding wordt verondersteld bij de toevoeging van de kleurstof op mM-niveaus (meer dan 95% van de bindingsplaatsen interageren met de kleurstof wanneer log K 4,4 of groter is), zoals in deze experimenten.
het bindingsaantal van kleurstofmoleculen met holo-Tf werd ook onderzocht door CZE-experimenten (gegevens niet getoond), beoordeeld op basis van de afname van de vrije kleurstofpiek voor een 1 mM CBB G-250 kleurstofmonster met en zonder toevoeging van 10 µM holo-TF., Aangezien het bindingsgetal werd gemeten als > 18, werd aangenomen dat het bindingsgetal van NHolo >20 was in de MICS-BN-PAGE experimenten (met 3,0 mM kleurstof toegevoegd). Dit bindingsaantal kleurstofmoleculen (> 20) van CZE-experimenten komt goed overeen met het aantal gebonden kleurstofmoleculen (N = 21) van moleculaire docking simulaties die aanleiding zouden geven tot de voorspelde affiniteit van -6,5 kcal/mol, en dus zijn onze resultaten zelfconsistent.,
uit deze moleculaire docking simulaties en cze experimenten blijkt dat CBB G-250 kleurstof de verschillende chemische structuren van holo – en apo-metalloproteïnen herkent om verschillende µ-waarden op te leveren. Meer gedetailleerde waarnemingen van de gesimuleerde bindingsmodi suggereren ook dat het CBB G-250 molecuul samenwerkt met aminozuurresiduen die toegankelijk zijn vanwege de meer open (uitgevouwen) apo-Tf structuur vergeleken met de meer gesloten (gevouwen) holo-Tf structuur, terwijl de kleurstof geen directe binding vertoont met Fe-bindende aminozuurresiduen (Asp392, Tyr429, Tyr517 en zijn 585)., Zo wordt impliciet dat de kleurstof kleine verschillen tussen de gevouwen en ontvouwde chemische structuren van metalloproteïnen herkent, die door de binding of dissociatie van metaalionen worden veroorzaakt. Dergelijke kleine verschillen kunnen niet met andere conventionele scheidingsmethoden worden vastgesteld.
aminozuurresiduen die in contact komen met het kleurstofmolecuul in elke kleurstofbindingsplaats in de simulatie (bijvoorbeeld aanvullende Fig. S10) werden gecategoriseerd volgens hun dominante aard: hydrofobe, hydrofiele of elektrostatische lading (zoals samengevat in aanvullende tabel S2 en tabel S3)., Volgens de resultaten vertoonden de populaties van elk type aminozuur dat in wisselwerking staat met kleurstofmoleculen geen verschil tussen holo – en apo-eiwitvormen (26-27% voor hydrofoob, 37-40% voor hydrofiele, 33-35% voor geladen residuen in elke vorm). Het aantal waterstofbindingen in apo-Tf (33 totaal; 1,2 per bindingsplaats) was echter aanzienlijk groter dan in holo-Tf (19 totaal; 0,9 per bindingsplaats). Bij de focus op de acht bindingsplaatsen in apo-Tf die niet aanwezig waren in holo-Tf (aanvullende tabel S3), bleek het aantal H-bindingen per locatie 2,1 te zijn., Deze resultaten suggereren sterk dat veranderingen in waterstofbindingsinteracties primair verantwoordelijk zijn voor de differentiatie tussen holo – en apo-Tf-vormen, terwijl verder onderzoek nodig zou zijn om het volledige mechanisme te begrijpen.