migração Diferencial de holo – e apo-metalloproteins por MICS-BN-PÁGINA
Enquanto não há separação de holo- (Fe2-transferrina (Tf)) e apo-Tf foi observado no convencional 1D nativo (CBB G-250 livres) PÁGINA (Fig. 1a) E SDS-PAGE (Fig., 1B), curiosamente, descobrimos que holo – e apo-Tf estão completamente separados por meio de MICS-BN-PAGE (Fig. 1c) (deve-se notar que duas bandas foram observadas para uma amostra apo-Tf “pura” usando BN-PAGE sem modo MICS devido à contaminação de íons metálicos; Fig suplementar. S1). Em SDS-PAGE, isso é provavelmente devido à dissociação de íons metálicos de holo-formas ocorrendo sob condições de desnaturação forte 14,15 (dados não mostrados). Este fato sugere que o reconhecimento eletroforético entre holo – e apo-formas não está disponível para métodos de páginas convencionais., Estes resultados implicam que agentes de desnaturação fracos específicos, como CBB-g 250 empregados em MICS-BN-PAGE, reconhecem a diferença entre holo – e apo-metalloproteínas para melhorar a separação, além de evitar dissociação de metal.
de migração Diferentes comportamentos para a holo – e apo-formas também foram observados para ceruloplasmina (Cp) vinculado com Cu2+ Cu (Cp) e superóxido dismutase (SOD) ligadas com Cu2+ e Zn2+ (Cu/Zn-SOD) pelo MICS-BN-PÁGINA método (Fig. 1d, e). A Apo-forms migrou para posições em estreita correspondência com seus pesos moleculares precisos em MICS-BN-PAGE (Fig., 1: Tf, 77 kDa; Cp, 134 kDa; SOD, 32 kDa), o que é útil para identificar as proteínas. Tal como descrito na secção de Introdução, Estes resultados levaram-nos a desenvolver a conversão holo/apo (HAC)-2D MCS-BN-PAGE metodologia para o isolamento selectivo das holo-metalloproteínas.
Concept of holo/apo conversion 2D MICS-BN-PAGE
Our new 2D PAGE method based on the differential migration between holo-and apo-metalloproteins, begins with a MICS-BN-PAGE stage conducted in two lanes (lanes a and B in Fig., 2, Painel i) permitir a separação das holo – e das apo-metoproteínas de uma amostra contendo ambas as formas de metaloproteína. As duas faixas são então submetidas a dois tratamentos diferentes após a separação inicial de MICS-BN-PAGE: A faixa A é submetida a uma segunda fase de MICS-BN-PAGE, mas apenas depois de passar por um tratamento de conversão holo/apo (Fig. 2 Painel II-1); enquanto a pista B é entregue em uma fase de detecção de metal para determinar os íons metálicos associados com as proteínas separadas (Fig. 2 Painel II-2). O tratamento aplicado à faixa B foi previamente validado., Por exemplo, a determinação de alguns iões de metais pesados (Cu2+, Fe3+, Co3+, Ni2+, Mn2+ e Cd2+) em pequenas amostras de volume (µL) em níveis ppt e sub-ppb por este método de página sem o uso de uma sala limpa foram relatados21. Além disso, esta metodologia tandem 1D MICS-BN-PAGE/metal detection PAGE revelou a distribuição precisa de Cu2+ no soro humano, mesmo para a ligação fraca à albumina (permutável) Cu2+ 21, e sugeriu que a proteína periplásmica Rubrivivax gelatinosus CopI altamente envolvida na resistência ao cobre é uma protein22 ligante ao cobre., Ainda assim, identificar completamente proteínas ligadas a Metais numa amostra complexa de proteínas é difícil devido à co-migração de proteínas. Por exemplo, não foi totalmente provado que CopI é uma proteína de ligação do cobre em R. gelatinosus, embora a sua sequência tenha três locais de ligação Cu putativos: (i) um centro de Cobre Tipo 1 presente em muitas cupredoxinas como Azurina e plastocianina, (ii) uma sequência n-terminus rica em histidina e (iii) uma sequência rica em histidina/Metionina. As proteínas relacionadas com o CopI estão presentes em muitas bactérias, mas não são amplamente conservadas; por exemplo, está ausente de Escherichia coli22., Até agora,apenas as proteínas de R. gelatinosus e Vibrio cholerae foram estudadas e estão envolvidas na resistência Cu22, 23. Em R. gelatinosus, a proteína CopI é altamente expressa na presença de UM2+; no entanto, o mecanismo de desintoxicação Cu ainda é Desconhecido. Assim, um método para o isolamento de metaloproteínas de todas as outras proteínas co-existentes em amostras biológicas complexas é necessário.
Conceito de HAC-2D MICS-BN-PÁGINA/detecção de metais PÁGINA metodologia., Painel I: 1D MICS-BN-PAGE em duas faixas. A Lane a foi submetida ao procedimento de conversão holo/apo em gel (como no painel II-1), e então a Lane A foi submetida a 2D MICS-BN-PAGE após a conversão holo/apo (como no painel III). A pista B foi submetida à página de detecção Cu2+ e Fe3+ (como no painel II-2). O electroferograma 2D destina-se a uma mistura de metaloproteínas (holo-Tf, apo-Tf, holo-Cp e holo-SOD), nas quais as holo-metaloproteínas da amostra original foram isoladas como manchas fora da linha diagonal (a linha amarela pontilhada no painel III). Versões de tamanho completo de eletroferogramas representados na figura., 2 são representados na figura. S2.
para ultrapassar esta limitação, a informação fornecida pela análise da Página 1D dos MICS-BN-PAGE/metal detection PAGE da Lane B é aumentada submetendo a Lane a uma segunda dimensão dos MICS-BN-PAGE após a conversão holo/apo. Para realizar esta análise, a faixa A é embebida pela primeira vez numa solução ácida, quelante metálico (ver secção de métodos e Suplementar para as condições detalhadas) para a conversão holo/apo (Fig. 2 Painel II-1)., Ao fazê-lo, as holo-metaloproteínas são derivatizadas em apo-metaloproteínas sem metal no gel da dimensão da primeira página. A faixa a tratada é então entregue na segunda fase dos MICS-BN-PAGE com a ajuda de um gel de agarose sem metal (ver informações suplementares). Na segunda fase do MICS-BN-PAGE (Fig. 2, Painel III), as apo-metaloproteínas e não-metaloproteínas da amostra original migram na linha diagonal, uma vez que a migração destas espécies na dimensão da segunda página é completamente idêntica à sua migração na dimensão da primeira página., Por outro lado, holo-metalloproteins da amostra original migrar distâncias diferentes no primeiro e segundo MICS-BN-dimensões da PÁGINA, uma vez que estas proteínas migram como seu holo-formulários na primeira dimensão, bem como a sua apo-formas na segunda dimensão (e desde MICS-BN-PÁGINA de resultados em diferentes mobilidade eletroforética para holo – e apo-formas de metalloproteins; vide infra). Assim, apenas as holo-metoproteínas da amostra original migram para fora da linha diagonal na segunda dimensão, a ser identificada por MALDI-TOF MS sem qualquer purificação adicional de proteína., Os tipos e quantidades de iões metálicos ligados com metaloproteínas na solução de amostra original (os isolados como pontos fora da diagonal), podem ser determinados pela página de detecção de metal da faixa B, como descrito acima. Assim, a informação relativa à identificação e distribuição de espécies de metaloproteína, juntamente com as identidades e concentrações de iões metálicos que ligam, é acessível a partir desta nova metodologia HAC-2D MICS-BN-PAGE/metal detection PAGE.,
isolamento selectivo das metaloproteínas em HAC-2D MICS-BN-PAGE
para a prova de conceito, foi demonstrada a HAC-2D MICS-BN-PAGE / metal detection PAGE PAGE para uma mistura de amostras contendo holo-Tf, apo-Tf, holo-Cp e Holo-SOD protein standards (resultando no electroferograma 2D na Fig. 2, Painel III), e também para uma amostra de soro humano (Figo suplementar. S3). Manchas de holo-metaloproteínas que migraram para fora da linha diagonal foram observadas com sucesso para a amostra mista de proteínas., Além disso, Fe3+ foi detectado na posição de holo-Tf, e Cu2+ nas posições de holo-Cp e holo-SOD, na primeira fase de MICS-BN-PAGE usando a página de detecção de metal. Se não for realizada nenhuma conversão holo/apo, todas as proteínas migram na linha diagonal (Figo suplementar. S5). Para uma amostra de soro humano, holo-Tf e holo-Cp foram detectados com sucesso (Fig. suplementar. S3)., Assim, concluiu-se que a página de detecção de HAC-2D MICS-BN-PAGE/metal é muito eficaz para o isolamento das holo-metaloproteínas e para a identificação dos iões metálicos originalmente ligados às metaloproteínas numa mistura de proteínas.finalmente, o método HAC-2D MICS-BN-PAGE foi aplicado a uma fracção proteica solúvel bacteriana total obtida a partir de células de R. gelatinosus cultivadas na presença de 1,2 mm Cu2+, expressando proteína CopI. Isto representa uma amostra biológica de proteína., Para esta amostra, foi encontrado um spot fora da linha diagonal na posição de 100 kDa e 29 kDa na primeira e segunda páginas, respectivamente (Fig. 3a). Uma alta concentração de 2 Um+ foi observada na posição de 97-139 kDa na primeira MICS-BN-PAGE (Fig. 3b). Por conseguinte, concluiu-se que a proteína presente neste local se lhe liga. A mancha foi cortada e posteriormente analisada pela MALDI-TOF em peptídeos correspondentes à CopI foram identificados(Fig. 3C, Suplemento Fig. S7 e quadro S1)., Além disso, quando esta mancha de gel foi executada na página SDS, foi observada uma única faixa de proteína CopI (dados não apresentados). Outra mancha fora da linha diagonal foi observada em cerca de 40 kDa (acima da mancha CopI 29 kDa na segunda dimensão (Fig. 3a)). Foi confirmado pela MALDI-TOF MS que esta mancha também se originou do CopI (e era provavelmente um dímero do CopI de acordo com o peso molecular). Assim, uma metaloproteína poderia ser especificamente isolada a partir de uma mistura complexa de proteínas, ao mesmo tempo que identificava o seu metal ligado., Esta análise por hac-2D MICS-BN-PAGE definitivamente provou que CopI é uma proteína de ligação de cobre, e curiosamente, que esta propriedade pode estar relacionada com a função Cu-desintoxicante da proteína no periplasma bacteriano. Outras análises quantitativas revelaram a estequiometria do íon Cu à CopI como 1: 1 (com base nas concentrações do íon Cu ligado (1,05 µM) e da proteína holo-CopI (0,95 µM) como determinado pela coloração de CBB R-250). Isto está em total acordo com outros resultados experimentais, que encontraram uma Cu: copi estequiometria de 1: 1.2 usando ICP-MS com CopI puro (Durand et al.,, unpublished data). Este resultado sugere que o nosso método também é útil para investigações de estoichiometrias da metaloproteína.
HAC-2D MICS-BN-PÁGINA empregando a mancha de prata (um), com Cu2+ detecção de PÁGINA (b), de uma fração solúvel obtida a partir de R. gelatinosus células cultivadas na presença de 1,2 mM de Cu2+ (total de proteína: de 31,5 µg). O spot off-diagonal indicado pelo asterisco na alínea a) foi submetido a MALDI-TOF MS (figura suplementar., S7), identificando as sequências mostradas em letra vermelha como parte da sequência Madura CopI (c). Versões de tamanho completo de eletroferogramas representados na figura. 3 estão representados na figura suplementar. S8.
de eletroforese Capilar experimentos para investigar modos de reconhecimento molecular
resolução de realce entre holo – e apo-formulários em MICROFONES-PÁGINA assistida com a CBB corante (Fig., 1c-e) é uma chave importante para a nossa metodologia, e, curiosamente, este reconhecimento molecular parece ter origem em diferentes números de CBB g-250 moléculas de Corante ligando – se a cada uma das holo-vs. apo-formas de metaloproteínas. Isto, por sua vez, provavelmente resulta em diferentes cargas efetivas, e / ou estruturas estéricas induzidas, para os complexos de proteínas corantes. Ambos os efeitos teriam impacto na mobilidade electroforética., Para obter uma visão mais profunda sobre o mecanismo de reconhecimento do corante CBB G-250 ligando – se a holo – e apo-Tf, experimentos CE foram realizados, juntamente com simulações de acoplagem usando o AutoDock Vina program 24,25 (vide infra). O CZE é conduzido em solução aquosa livre sem uma matriz de gel, pelo que não é necessário considerar um efeito de peneiração molecular nas simulações. A mobilidade eletroforética de holo-Tf medida por CZE foi obviamente diferente da da apo-Tf com a adição do corante CBB (Fig. 4), enquanto estas proteínas tinham mobilidades idênticas na ausência do corante., Este fato sugere fortemente que o número de moléculas de Corante ligadas com holo – e apo-metaloproteínas é diferente. Na CZE, a migração da proteína-dye complexo seria predominantemente afetado pela carga efetiva do complexo, que, por sua vez, seria afetado pelo número de solteiros-carregada aniônico CBB moléculas de corante ligadas à proteína.,
Típica electropherograms de CZE experiências: 10 µM de holo – ou apo-Tf sem CBB G-250 (superior verde de rastreamento); e as misturas contendo 5 mM CBB G-250 tintura com 10 µM de holo-Tf (meio azul de rastreio) ou com 10 µM de apo-Tf (inferior vermelho de rastreamento).,
Tradicionalmente, a mobilidade eletroforética de uma proteína em solução livre é representado pela equação de Henry, como mostrado na equação (1):
Aqui, Q, η, R e k representam a carga líquida, a solução viscosidade, o raio da proteína, e o inverso do comprimento de Debye da solução eletrolítica. A função Henry, h, aumenta monotonicamente de 2/3 para 1., Estritamente falando, esta fórmula aplica-se exclusivamente a uma molécula esférica com uma distribuição de carga centrosimétrica, embora haja algumas discussões para modificar a equação de Henry para se aplicar a proteínas não esféricas com distribuição de carga complexa (incluindo dipolo e quadrupolo)26. No nosso caso, as moléculas holo – e apo-Tf São esferas deformadas de tamanho muito semelhante (lembrando esferóides com comprimentos de eixo longos e curtos de aproximadamente 92 e 60 Å (holo-Tf), e 93 e 68 Å (apo-Tf), respectivamente) (figura suplementar. S9)., Adicionalmente, espera-se que o dipolo e o quadrupolo tenham apenas um pequeno efeito sobre a mobilidade, uma vez que as moléculas CBB G-250 ligadas a holo-/apo-Tf não estão localizadas, como mostrado na figura suplementar. S9 (ver abaixo). The results of precise calculations by Kim et al.26 mostram que a mobilidade eletroforética de um esferoidal a proteína não é significativamente afetada por uma quadripolares em soluções de baixa força iônica (I < 0,01 M), e a força iônica da separação de buffer no nosso CZE experimentos foi igualmente baixos (I = 0,013 M).,
Assim, a razão de mobilidades eletroforética de apo e holo-Tf complexado com a CBB G-250 corante (ou seja, µApo/µHolo), é atribuída à razão entre o líquido de encargos de cada complexo (ou seja, QApo/QHolo), que pode ser facilmente derivada da equação de Henry. As cargas líquidas negativas dos complexos Tf-CBB G-250 provêm principalmente do número de ligação do corante. Consequentemente, o valor de µApo/µHolo também dá a razão dos números do corante (nomeadamente, NApo/NHolo). Experimentalmente, a razão da mobilidade electroforética das duas formas de Ft (µApo/µHolo = (-2.69 × 10-4)/(-2.,09 × 10-4))) foi encontrado para ser 1,29 por CZE (Fig. 4), que corresponde à razão de carga elétrica efetiva, desde que os tamanhos de ambas as formas de Tf sejam similares. Assim, a razão de mobilidades eletroforéticas deve concordar com a razão de ligação de moléculas de Corante. No entanto, é necessária uma discussão mais aprofundada sobre a relação entre a mobilidade electroforética e a forma proteica para outras metaloproteínas nos casos em que as formas holo – e apo-proteicas diferem (como para Cp).,
Molecular do acoplamento de simulação de experimentos para investigar modos de reconhecimento molecular
Tintura de ligação foi determinada pelo flexíveis molecular de ancoragem simulações de AutoDock Vina27, projetado de forma exaustiva busca por sítios de ligação e para calcular sua energia livre (Fig. 5 e Figo suplementar. S9). Recentemente, Wang et al.25 relatou que o AutoDock Vina tem uma alta potência de pontuação e potência de amostragem intermediária em relação a outros programas de acoplagem amplamente utilizados., De acordo com estas simulações, um maior número de moléculas de Corante CBB G-250 ligadas a locais vagos de ligação Fe na apo-Tf em comparação com holo-Tf (Fig. 5-A) foram observados. Com base nestas simulações de Vina, verificou-se que a razão entre o número de ligação do corante NApo/NHolo era de 1,23, com uma energia de ligação <-6,5 kcal/mol (correspondente a K~104,4 M−1) (Fig. 5b para o número de ligação do corante distribuição cumulativa de frequências em função da energia de ligação), que está de acordo com os nossos resultados CZE, discutido anteriormente (NApo/NHolo = 1,29)., Presume-se a ligação quantitativa com a adição do corante a níveis mM (mais de 95% dos locais de ligação interagem com o corante quando log K é 4.4 ou maior), como nestes experimentos.
O número de ligações de moléculas de corante com holo-Tf foi também investigado por experiências CZE (dados não apresentados), como se conclui da diminuição do Pico de corante livre para uma amostra de corante 1 mm CBB G-250 com e sem adição de holo-Tf de 10 µM., Uma vez que o número de ligação foi medido para ser >18, o número de ligação de NHolo foi presumido para ser >20 nos experimentos MICS-BN-PAGE (com 3,0 mM de Corante adicionado). Este número de ligação de moléculas de corante (>20) de CZE experimentos está em bom acordo com o número de dependente moléculas de corante (N = 21) de docking molecular simulações que daria origem ao previsto afinidade de -6.5 kcal/mol, e portanto, os nossos resultados são auto-consistente.,
é visto a partir destas simulações de acoplagem molecular e experimentos CZE que o corante CBB G-250 reconhece as diferentes estruturas químicas das holo – e apo-metaloproteínas para produzir diferentes valores µ. Observações mais detalhadas de simulação de modos de vinculação também sugerem que a CBB G-250 molécula interage com resíduos de aminoácidos acessível devido ao mais aberto (desdobrado) apo-Tf estrutura comparado com o mais fechado (dobrado) holo-Tf estrutura, enquanto que o corante não mostra nenhuma ligação direta com Fe-vinculação de resíduos de aminoácidos (Asp392, Tyr429, Tyr517 e Sua 585)., Assim, está implícito que o corante reconhece pequenas diferenças entre as estruturas químicas dobradas e não dobradas das metaloproteínas, que são induzidas pela ligação ou dissociação de íons metálicos. Tais pequenas diferenças não podem ser identificadas por quaisquer outros métodos convencionais de separação.resíduos de aminoácidos em contacto com a molécula de corante em cada local de ligação de corante na simulação (por exemplo, Fig. suplementar). S10) foram categorizados de acordo com sua natureza dominante: carga hidrofóbica, hidrofílica ou eletrostática (como resumido no quadro suplementar S2 e no quadro S3)., De acordo com os resultados, as populações de cada tipo de aminoácido interagindo com moléculas de corante não mostraram diferença entre formas holo – e apo-proteicas (26-27% para hidrofóbicos, 37-40% para hidrofílicos, 33-35% para resíduos carregados em cada forma). No entanto, o número de ligações de hidrogénio na apo-Tf (33 total; 1,2 por local de ligação) foi significativamente maior do que na holo-Tf (19 total; 0,9 por local de ligação). Ao concentrar-se nos oito locais de ligação na apo-Tf que não estavam presentes na holo-Tf (quadro suplementar S3), verificou-se que o número de ligações H por local era de 2.1., Estes resultados sugerem fortemente que as alterações nas interacções das ligações de hidrogénio são principalmente responsáveis pela diferenciação entre formas holo – e apo-Tf, ao passo que seria necessária uma investigação mais aprofundada para compreender o mecanismo completo.