Oncologia Relatórios

Introdução

as espécies Reactivas de oxigénio (ROS) são altamente unstableand reativa moléculas contendo oxigênio metades. Incluem peróxido de hidrogénio (H2O2), anião superóxido(O2●−) e radical hidroxilo (Oh).Embora sejam reconhecidos como agentes citotóxicos, eles podem servir mensageiros assecond para controlar muitos eventos celulares de geneexpressão, diferenciação, proliferação celular e morte celular(1,2)., A ROS é continuamente gerada por metabolismo aeróbico endógeno dentro das células na forma de teo2● – e / ou é feita propositadamente por oxidases,tais como fosfato dinucleotídico de nicotinamida (NADPH) oxidaseand xantina oxidase (3).O2● – é convertido em H2O2 pela enzima superóxido dismutase(4). H2O2 isfurter transformado em O2 e H2O por catalaseor glutationa peroxidases (5).Em comparação com outros membros da ROS, não-radicalH2O2 é capaz de penetrar livremente celmembranes, e interage com ferro ferro ferro ferro (química de Fenton),que produz o altamente destrutivo e de curta duração●OH., A produção de diferentes formas de ROS a vários níveis pode ser útil ou prejudicial para as células e tecidos.Em especial, quantidades excessivas de MDE podem ser o resultado da sua sobreprodução e/ou redução da regulamentação dos antioxidantes.O aumento dos níveis de ROS pode resultar em danos ao DNA, proteínas e plípidos nas células, implicando-os na etiologia de várias humandiseases, incluindo câncer (6-9).a apoptose é a morte celular programada e ocorre em duas vias diferentes: a via intrínseca mitocondrial e a via extrínseca mediada pelo tereceptor (10)., O passo chave na apoptose mediada pelo itocondrial é a translocação do citocromec da mitocôndria para o citosol e sua subsequente interação com Apaf-1 e caspase-9 para formar um complexo(apoptossoma). O apoptosome ainda ativa a caspase-3,-6 e -7 (11). Inversamente, a via extrínseca começa com a ligação de ligantes específicos, tais como TNF-α,TRAIL e Fas aos respectivos receptores da morte celular, que estimulam as actividades da caspase-8 e -3 (12)., Caspase-8 cliva LANCE, apro-apoptótico cytosolic proteína Bcl-2 em família, para gerar atruncated produto, tBID que entra na mitocôndria anddecreases o potencial de membrana mitocondrial (MMP;ΔΨm), causando a liberação de citocromo c. Thetranslocation de outro apoptótico proteína Bax do citosol para a mitocôndria também provoca uma perda semelhante de MMP(ΔΨm). Caspase-3 é a principal caspase executiva; sua ativação pode sistematicamente desmontar a integridade das células através da clivagem de várias proteínas chave, tais como poli(ADP-ribose)polimerase (PARP) e RhoGDI.,os pulmões são susceptíveis a uma variedade de lesões transmitidas pelo ar e pelo sangue que podem, consequentemente, causar fibrose pulmonar e cancro (13). Considera-se que a carcinogénese do cancro do pulmão está estreitamente ligada à inflamação do tecido mediada pelo H2O2. Durante ainflamação, prevê-se que as concentrações nos tecidos de H2O2 atinjam níveis quase milimolares, ao passo que os níveis baixos de H2O2 produzidos por oxidantes NADPH em condições normais são considerados como não tendo um impacto mais elevado do que o microambiente da membrana plasmática, tais como os lipidrafts (14,15)., No entanto,em ambos os casos, o H2O2 pode modular funções celulares vitais de proliferação celular, morte e diferenciação através da mudança de signalingcascades e expressão genética e seus níveis mais elevados podem levar aapoptose e/ou necrose. O H2O2 exógeno é frequentemente utilizado como o ROS representativo para simular oress oxidativo nas células e tecidos. O H2O2 é relativamente não tóxico para as células normais das células veinendoteliais umbilicais humanas e das células musculares lisas da artéria pulmonar humana(16,17). A morte de células cancerígenas do pulmão provocada por H2O2 pode ter interesse em investigação citotoxicológica.,

no presente estudo, os efeitos moleculares do H2O2 exógeno sobre as células cancerígenas do pulmão de Calu-6 e A549 foram avaliados em relação ao crescimento celular e à morte, assim como os efeitos anti-apoptóticos de vários inibidores da caspase foram investigados em células cancerígenas do pulmão tratadas com H2O2.,

Materiais e métodos

cultura de Células

O humano câncer de pulmão Calu-6 e A549 célula lineswere adquiridos a partir do coreano Célula da Linha de Banco (Seul, Coreia) andwere cultivadas em RPMI-1640 meio suplementado com 10% fetalbovine soro (FBS; Sigma-Aldrich, Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha)e 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco-BRL; Thermo FisherScientific, Inc., Waltham, MA, USA). Estas células foram regularmente recolhidas em pratos de cultura de tecidos de plástico de 100 mm (Nunc, Roskilde, Dinamarca) e colhidas com uma solução de tripsin-EDTA (Gibco-BRL;Thermo Fisher Scientific, Inc.).,

Reagentes

crescimento Celular e da célula numberassays

o crescimento de Células alterações foram avaliados por assessing3-(4,5-dimethylthiazol-2-il)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT;Sigma-Aldrich, Merck KGaA) de tintura de absorvância como descrito anteriormente(19). Os números de células viáveis e mortas foram determinados pelo método de coloração de células azuis de trypan (20). As células foram expostas às montanhas designadas de H2O2 com ou sem 15 µM de inibidor da eachcaspase durante 24 horas.,

ciclo celular e análise celular sub-G1

ciclo celular e análise celular sub-G1 foram realizadas por iodeto de propídio (PI; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) coloração anteriormente descrita (20). As células foram expostas às quantidades designadas de H2O2 com ou sem 15 µM de cada cspaseinhibitor durante 24 h. as distribuições do ciclo celular foram analisadas com o Citómetro de fluxo de aFACStar (Becton-Dickinson and Company, FranklinLakes, NJ, EUA).,

A cor da cor em V-FITC para a morte celular

a morte de células apoptóticas foi verificada através da medição de células encadeadas com isotiocianato de fluoresceína-Anexo V (FITC;Invitrogénio; Thermo Fisher Scientific, Inc.) como descrito anteriormente (20). As células foram expostas às quantidades designadas de H2O2 com ou sem 15 µm de cada inibidor da caspase durante 24 horas. a coloração do Anexo V-FITC foi analisada com um citómetro de fluxo FACStar (Becton-Dickinson e companhia).,

A avaliação do MMP (ΔΨm)

MMP (ΔΨm) foi avaliada por um corante fluorescente de rhodamina123 (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) como descrito anteriormente (21). As células foram expostas às quantidades designadas de H2O2 com ou sem 15 µM de cada inibidor da caspase durante 24 h. A intensidade da rodamina 123 foi analisada por um citómetro de fluxo FACStar(Becton-Dickinson and Company). A ausência de rodamina 123 a partir das células indicou a perda de MMP (ΔΨm) em cancercells pulmonares., Os níveis de MMP (ΔΨm) nas células que não incluem as células com perda de MMP(ΔΨm) foram expressos como a fluorescência média, que foi estimada por Software CellQuest (versão 5.1;Becton-Dickinson and Company).

Western blot analysis

As alterações nas células tratadas com Bcl-2, caspase-3 e PARP inH2O2 foram analisadas por westernblotting. Brevemente, 1×106 células em pratos de cultura de 60 mm(Nunc) foram incubadas com as quantidades designadas de H2O2 para 24 h. As amostras contendo 20 µg de totalproteína foram separadas por 8 ou 12. ,5% de SDS-PAGE em gel, transferidos toImmobilon-P membranas de PVDF EMD (Millipore, Billerica, MA, EUA) byelectroblotting e, em seguida, sondou com anti-Bcl-2, anti-caspase-3,anti-PARP e anti-β-actina (diluição 1:5,000; Santa CruzBiotechnology, Santa Cruz, CA, EUA). As membranas foram tratadas com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de corseradish (dilution1:5.000; Cell signaling Technology, Inc.). Blots were developed byymeans of an ECL kit (Amersham Life Science, Arlington Heights, IL,USA).,

quantificação das caspase-3 e-8 actividades

As actividades da caspase-3 e -8 foram avaliadas com kits colorimétricos de bycaspase-3 e -8 (R&d Systems, Inc.) anteriormente descrito (20). Inbrief, 1×106 células em pratos de cultura de 60 mm (Nunc) foram tratadas com 75 µM H2O2 durante 24 h. foram utilizadas amostras contendo 50 µg de proteína total para avaliar as actividades da caspase-3 e −8.

análise estatística

dados representando pelo menos dois experimentos independentes (média ± DP) foram analisados através de software InStat(GraphPad Prism4; GraphPad Software, Inc.,, San Diego, CA, USA). O teste t de TheStudent ou análise unidirecional da variância (ANOVA) com a análise póstoc usando o teste de comparação múltipla de Tukey foi usado para dados paramétricos. P < 0,05 foi considerado como indicando diferença astatisticamente significativa.os efeitos celulares de H2O2 no crescimento das células cancerígenas do pulmão foram examinados às 24 horas., Tratamento com células de Calu-6 mortas (tripanblue-positivas) de 50-250 µM H2O2 significativamente redutíveis (trypan blue-negative) e aumentadas de forma dependente da dose (Fig. 1A). Com base em ensaios de MTT, 50-250 µMH2O2 atenuou significativamente o crescimento de células decalu-6 com uma CI50 de ~50 µM (Fig. 1B). Quando a distribuição do ciclo celular nas células de Calu-6 tratadas com H2O2 foi examinada, as células de Calu-6 tratadas com 75 µM de H2o2demonstraram uma paragem significativa da fase G1 do ciclo celular em comparação com as células de controlo (Fig.2A e B)., Tal como no Calu-6, com o tratamento com H2O2, o número de A549 células viáveis diminuiu e as células mortas aumentaram significativamente de forma dependente da dose (Fig. 1C). Além disso, H2O2 reduziu de forma dependente da dose o crescimento de 549 células com uma CI50 de ~100 µM (Fig. 1D). O tratamento com 100 µMH2O2 também induziu significativamente um pico G1-phasearrest nas células A549 em comparação com as células de controlo(Fig. 2A e B).subsequentemente, o papel do H2O2 na morte de células cancerígenas do pulmão foi investigado para aumentar a compreensão., Enquanto 50-100 µM H2O2 aumentou significativamente as percentagens de células sub-G1 em Calu-6cells, 250 µM H2O2 não aumentou a percentagem de células sub-G1 nestas células(Fig. 2A e C). No entanto, o tratamento com H2O2 de50–250 µM, dependente da dose, aumentou os números de células coradas com FITC do anexo na célula de Calu-6(Fig. 3A). Quando o efeito de H2O2 sobre MMP (ΔΨm) em células de Calu-6 foi avaliado utilizando rodamina 123, H2o2provocou a perda de MMP (ΔΨm) num homem dependente da dose (Fig. 3B)., No que diz respeito ao nível de toMMP (ΔΨm) nas células de Calu-6, excluindo as células de coloração da negativerhodamina 123, o H2O2 decreduziu o nível de MMP (ΔΨm) nas células de Calu-6 numa pessoa dependente da dose (Fig. 3C). Nas células A549, o tratamento de 50 e 100 µM H2O2 aumentou significativamente as percentagens de células sub-G1, mas o tratamento com 250 e 500 µM H2O2 não mostrou este efeito(Fig. 2A e C).H2O2 aumentou de forma dependente da dose o número de células A549 manchadas por FITC comannexina (Fig.3D). Adicionalmente, H2O2, dependente da dose, induziu a perda de MMP (ΔΨm)nas células A549 (Fig. 3E)., Enquanto 50 µMH2O2 aumentou o nível de MMP (ΔΨm) nas 549 células, 100-250 µM H2O2 diminuiu significativamente os níveis de MMP (ΔΨm) nestas células (Fig. 3F).

H2O2 proteínas relacionadas com a apoptose e caspases em células cancerígenas do pulmão tratadas com caspases

A avaliação das proteínas relacionadas com a apoptose durante a morte das células pulmonares induzidas pela apoptose revelou que a bbcl-2, uma proteína anti-apoptótica, diminuiu o tratamento com uponH2O2 em células Calu-6 (Fig. 4A). O nível de pro-caspase-3 foi reduzido em 75 µM H2O2 (Fig. 4A). A forma ininterrupta de 116 kDa PARP não foi alterada por H2O2 (Fig. 4A)., Verificou-se que a actividade da caspase-3 aumentou nas Calu-6cells tratadas com H2O2, enquanto que a da caspase-8 não se alterou significativamente(Fig. 4B). O tratamento com 50-100 µMH2O2 parece diminuir os níveis de proteína Bcl-2, pro-caspase-3 e PARP nas células A549 (Fig. 4C). Especificamente, 100 µMH2O2 mostraram uma diminuição acentuada nos níveis destas proteínas. O tratamento com 75 µM H2O2 aumentou significativamente a actividade da caspase-3 nas células A549 e aumentou significativamente a actividade da caspase-8 (Fig. 4D).,os inibidores da Caspase afectam o crescimento celular e a morte nas células cancerígenas pulmonares tratadas com H2O2. As células de Calu-6 e A549 foram pré-incubadas com inibidores da caspase de 15 µM durante um tratamento de 1 h com 75 ou 100 µM de H2O2. Nenhum dos inibidores da caspase testados influenciou a inibição do crescimento induzida pelo H2O2 em ambas as linhas celulares Calu-6 e A549(Fig. 5A e D)., No entanto, todos os inibidores daaspase testados em ocalu-6 tratado com H2O2 diminuíram as percentagens de células Sub-G1 para o nível das células de controlo (Fig. 5B). Além disso, o tratamento com todos os inibidores da caspase testados reduziu significativamente o número de células coradas com FITC do anexo na célula Calu-6 tratada com 2O2, mas o efeito reduzido foi mais fraco em comparação com a diminuição das células sub-G1(Fig. 5C). Todas as células do cáspaseinhibitores resgataram marcadamente 549 células da morte celular promovida por H2O2, conforme avaliado pela população de células sub-G1 (Fig.5E)., Além disso, estes inibidores reduziram significativamente o número de células A549 tratadas com FITC do Anexo V (Fig. 5F). Cada inibidor da caspase teve efeitos anti-morte muito semelhantes nas células cancerígenas do pulmão tratadas com H2O2.os inibidores da Caspase afectam o MMP(ΔΨm) nas células cancerígenas pulmonares tratadas com H2O2

a morte celular está fortemente associada ao colapso do MMP (ΔΨm) (22).Assim, o MMP (ΔΨm) em 75 ou 100 µMH2O2 de células cancerígenas do pulmão tratadas com MMP (ΔΨm) foi determinado com ou sem cada um dos inibidores da caspase às 24 horas., No entanto, todos os inibidores daaspase não reduziram significativamente a perda de MMP(ΔΨm) nas células de Calu-6 tratadas com H2O2(Fig. 6A). Além disso, a maioria destes inibidores não influenciou o nível de MMP (ΔΨm) nas células de Calu-6 tratadas com H2O2. Contudo, o inibidor da caspase-9 (Z-LEHD) pareceu aumentar a diminuição do nível destas células (Fig. Em células A549, todos os inibidores da caspase impediram parcialmente a perda de MMP (ΔΨm) por H2O2(Fig. 6C). As células A549 tratadas com InH2O2, inibitoras da caspase-9 aumentaram ainda mais a diminuição do nível de MMP (ΔΨm) (Fig. 6D)., Esta inibitoralona reduziu significativamente os níveis de MMP (ΔΨm) nas células de controlo de Calu-6 e A549 (Fig. 6B andD).

a discussão

o cancro do pulmão representa uma das principais causas de mortalidade relacionada com o cancro a nível mundial e está relacionada com a maliciosa actividade da ROS. No presente estudo, o exogenousH2O2 foi utilizado para gerar estressina oxidativa nas células cancerígenas do pulmão. Este estudo centrou-se na definição dos molecularmecanismos da inibição do crescimento celular e morte celular em Calu-6 tratado com 2O2 e em cancros pulmonares tratados com A549., Com base nos ensaios de MTT, após uma exposição de 24-h, os valores de teic50 para H2O2 foram de ~50 e 100 µM nas células Calu-6 e A549, respectivamente.O H2O2 aumentou, em função da dose, o número de células manchadas de Calu-6 e A549, marcadas com H2O2, o que indica que a morte de células cancerígenas do pulmão induzidas pelo H2O2 ocorreu através da apoptose. Evidentemente, H2O2decreased the levels of Bcl-2 and pro-caspase-3 in both cell types.O PARP foi reduzido nas células a549cel tratadas com H2O2. Além disso, as actividades das células caspase-3 e -8 foram aumentadas em ambos os tipos de células tratadas com H2O2.A apoptose está fortemente relacionada com o colapso do MMP(ΔΨm) (22).,H2O2 despoletou a perda de MMP (ΔΨm) em células de Calu-6 e A549 num homem dependente da dose, indicando que a morte de células cancerígenas do pulmão por H2O2 estava intimamente relacionada com o colapso de MMP (ΔΨm). Além disso, H2O2decreased the MMP (ΔΨm) level in lung cancer cellscontaining the rhodamine 123 dye.

apesar de 50-100 µM H2O2 terem aumentado significativamente as percentagens de sub-G1 Calu-6 e A549cells, 250 ou 500 µM H2O2 não demonstraram efeito semelhante, indicando que as doses mais elevadas de H2O2 fixaram estas células cancerígenas de forma semelhante ao etanol ou ao metanol., Assim, o H2O2 parece induzir o cancro do pulmão a morte celular simultaneamente por necrose e apoptose, dependendo da sua concentração. Em particular, 75 e 100 µMH2O2 apareceu simultaneamente desencadear bothapoptosis e necrose na Calu-6 células, uma vez que estas doses ofH2O2 não aumentar as percentagens ofsub-G1 células, em comparação com 50 µM de H2O2-treatedcells, bem como não houve alteração nos níveis de intactform do PARP proteína. É necessário avaliar a actividade da lactato desidrogenase extracelular nas células do cancro do pulmão com 50 – 500 µM H2O2 para a detecção da morte das células necróticas., Estudos anteriores revelaram um roleof H2O2 no ciclo celular da fase prisão andprogression ajustando o ciclo celular-proteínas relacionadas (23,24).Em linha com este, o tratamento com 75 ou 100 µMH2O2 entre as doses testadas significantlyshowed G1 fase prisão em Calu-6 e células A549. Assim, a paragem da G1fase juntamente com a indução da morte celular é o potencial mecanismo por detrás da atenuação do tratamento do crescimento celular uponH2O2. No entanto, o H2O2 não efectuou quaisquer atrasos de fase específicos do ciclo celular nas células HeLa (20)., Estes resultados indicaram que o stress oxidativo induzido pelo that2o2 manifestava os seus efeitos na progressão do ciclo celular, dependendo do tipo celular e da dose de H2O2.os inibidores da Caspase utilizados nesta experiência não conseguiram atenuar a inibição do crescimento nas células cancerígenas tratadas com Calu-6 e A549,enquanto que estes inibidores evitaram consideravelmente a morte celular induzida pelo H2O2 nestas células.Embora o H2O2 tenha aumentado em certa medida a actividade da caspase-8 em ambas as células cancerígenas do pulmão, a caspase-8inibitor atenuou significativamente a morte celular provocada pelo H2O2., Assim, uma ligeira alteração na actividade da caspase-8 parece ter um forte impacto na Via apoptótica das células lungcancer tratadas com H2O2. Estes resultados também indicaram que ambas as vias receptoras da morte mitocondrialaland celular eram mutuamente necessárias para a indução embrionária da apoptose nas células cancerígenas tratadas com H2O2. Seria importante determinar como o H2O2 afecta o receptor da morte celular pode induzir apoptose nas células cancerígenas do pulmão. No que se refere ao MMP(ΔΨm), os inibidores da caspase não tiveram qualquer efeito significativo na perda de células de Calu-6 e A549 tratadas com MMP (ΔΨm)., Além disso, estes inibidores não restabeleceram a diminuição dos níveis de MMP(ΔΨm) nas células lungcancer tratadas com H2O2. Em vez disso, o inibidor da caspase-9 aumentou os níveis descrezados nestas células. É plausível que a perda de ofMMP (ΔΨm) após o tratamento withH2O2 ativado vários passos relacionados tomitochondrial e a morte de células do receptor caminhos, consequentlyinducing apoptose, e a ativação de passos byH2O2 não poderia positivamente melhorar a MMP(ΔΨm) perda., Além disso, a perda de MMP(ΔΨm) induzida por H2O2 pode não ser suficiente para provocar completamente a apoptose em células de Calu-6 e A549 sob a regulamentação da actividade da caspase.em conclusão, o H2O2 inibiu o crescimento das células cancerígenas do pulmão através da morte celular e da fase terminal do ciclo celular. A morte celular de Calu-6 e A549 causada por H2O2 resultou de necrose, bem como apoptose dependente da ascaspase (Fig.7). Os resultados actuais fornecem informações úteis para compreender o efeito citotoxicológico do exogenousH2O2 nas células cancerígenas do pulmão no que se refere ao crescimento celular e à morte., Além disso, novas estratégias para o tratamento do cancro do pulmão, baseadas no uso de H2O2, podem ser úteis para reduzir a mortalidade relacionada com esta malignidade.Não aplicável.

Financiamento

O presente estudo foi apoiado por uma bolsa do national Research Foundation, da Coreia (NRF), financiado pela Koreangovernment (MSIP; 2016R1A2B4007773) e apoiado pela ‘ResearchBase Construção o Apoio do Fundo do Programa”, nanciado pelo Chonbuk NationalUniversity em 2018.,todos os dados gerados ou analisados durante este estudo estão incluídos neste artigo publicado.

as contribuições dos autores

WHP foi o único contribuinte para a concepção e concepção, aquisição de dados, análise e interpretação de dados e escrita do manuscrito. A PST é responsável por todos os aspectos do trabalho, assegurando que as questões relacionadas com a exactidão ou a integridade de qualquer parte do trabalho sejam adequadamente investigadas e resolvidas.Não aplicável.,autorização do doente para publicação Não aplicável.o autor declara que não tem interesses concorrentes.,-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide

FITC

fluorescein isothiocyanate

pi

propidium iodide