o desenvolvimento, diferenciação e crescimento de células e tecidos requerem padrões regulamentados com precisão de expressão genética. Enhancers work as cis-regulatory elements to mediate both spatial and temporal control of development by turning on transcription in specific cells and / or repressing it in other cells. Assim, a combinação particular de fatores de transcrição e outras proteínas de ligação ao DNA em um desenvolvimento de controles tecidulares que os genes serão expressos nesse tecido. Os potenciadores permitem que o mesmo gene seja usado em diversos processos no espaço e no tempo.,
identificação e caracterizationedit
tradicionalmente, os potenciadores foram identificados por técnicas de armadilha de potenciador usando um gene repórter ou por análise de sequência comparativa e genômica computacional. Em modelos geneticamente tratáveis como a mosca da fruta Drosophila melanogaster, por exemplo, uma construção repórter como o gene lacZ pode ser aleatoriamente integrado no genoma usando um transposon elemento P. Se o gene repórter se integra perto de um potenciador, sua expressão irá refletir o padrão de expressão impulsionado por esse potenciador., Assim, manchar as moscas para a expressão ou atividade de LacZ e clonar a sequência em torno do local de integração permite a identificação da sequência do potenciador.
o desenvolvimento de tecnologias genômicas e epigenômicas, no entanto, mudou drasticamente as perspectivas para a descoberta de módulos regulamentares cis (CRM)., Métodos de sequenciamento de próxima geração (NGS) agora permitem testes de descoberta de CRM funcionais de alta capacidade, e as quantidades cada vez maiores de dados disponíveis, incluindo grandes bibliotecas de sites de ligação de fatores de transcrição (TFBS), coleções de CRMs anotados, validados e extensos dados epigenéticos em muitos tipos de células, estão fazendo da descoberta de CRM computacional precisa um objetivo alcançável. Um exemplo de abordagem baseada em NGS chamada DNase-seq permitiu a identificação de regiões de cromatina esgotadas ou abertas, que podem conter CRM., Mais recentemente, foram desenvolvidas técnicas como a ATAC-seq, que exigem menos material de base. As regiões com depleção de nuclelossomas podem ser identificadas in vivo através da expressão da Dam metilase, permitindo um maior controlo da identificação do potenciador específico do tipo celular.Métodos computacionais incluem genômica comparativa, agrupamento de sites conhecidos ou previstos de ligação TF, e abordagens supervisionadas de aprendizagem de máquinas treinadas em CRMs conhecidos., Todos estes métodos provaram ser eficazes para a descoberta de CRM, mas cada um tem suas próprias considerações e limitações, e cada um está sujeito a um maior ou menor número de falsos positivos identifications.In a abordagem genómica comparativa, a conservação de sequências de regiões não codificantes pode ser indicativa de potenciadores. Sequências de várias espécies são alinhadas, e regiões conservadas são identificadas computacionalmente., Sequências identificadas podem então ser anexadas a um gene repórter como a proteína verde fluorescente ou lacZ para determinar o padrão in vivo de expressão do gene produzido pelo potenciador quando injetado em um embrião. a expressão mRNA do repórter pode ser visualizada por hibridização in situ, que fornece uma medida mais direta da atividade potenciadora, uma vez que não está sujeita às complexidades da tradução e dobragem de proteínas., Embora muitas evidências apontem para a conservação de sequências para potenciadores críticos do Desenvolvimento, outros trabalhos têm mostrado que a função de potenciadores pode ser conservada com pouca ou nenhuma conservação da sequência primária. Por exemplo, os realçadores RET em seres humanos têm muito pouca conservação de sequência para aqueles em peixes-zebra, no entanto, as sequências de ambas as espécies produzem padrões quase idênticos de expressão do gene repórter em peixes-Zebra., Da mesma forma, altamente divergente insetos (separados por cerca de 350 milhões de anos), de gene semelhante padrões de expressão de vários genes chave foi encontrado para ser regulados através da mesma forma constituída CRMs embora estes CRMs não mostram qualquer apreciável sequência de conservação podem ser detectados pelo padrão de seqüência de alinhamento como métodos de JATEAMENTO.
In segmentation of insectsEdit
The enhancers determining early segmentation in Drosophila melanogaster embriões are among the best characterized developmental enhancers., No embrião da mosca precoce, os fatores de transcrição do gene gap são responsáveis por ativar e reprimir uma série de genes de segmentação, tais como os genes de regra do par. Os genes gap são expressos em blocos ao longo do eixo anterior-posterior da mosca juntamente com outros fatores de transcrição efeito materno, criando assim zonas dentro das quais diferentes combinações de fatores de transcrição são expressas. Os genes da Regra do Par são separados um do outro por células não expressivas. Além disso, as listras de expressão para diferentes genes de regras de pares são compensadas por alguns diâmetros celulares um do outro., Assim, combinações únicas de expressão genética de pares criam domínios espaciais ao longo do eixo anterior-posterior para configurar cada um dos 14 segmentos individuais. O potenciador 480 bp responsável por conduzir a faixa afiada dois do gene da regra par-pulou (eve) foi bem caracterizado. O potenciador contém 12 locais de ligação diferentes para factores de transcrição genética materna e gap. Activar e reprimir locais sobrepõem-se em sequência., Eve é expressa apenas em uma faixa estreita de células que contêm altas concentrações dos ativadores e baixa concentração dos repressores para esta sequência do potenciador. Outras regiões potenciadoras conduzem a expressão de Eva em outras 6 listras no embrião.o estabelecimento de eixos corporais é um passo crítico no desenvolvimento animal. Durante o desenvolvimento embrionário do rato, Nodal, um fator de crescimento transformador-beta superfamília ligand, é um gene chave envolvido em padronizar tanto o eixo anterior-posterior e o eixo esquerdo-direito do embrião inicial., O gene Nodal contém dois potenciadores: o potenciador Epiblast Proximal (PEE) e o potenciador assimétrico (ASE). O PEE está a montante do gene Nodal e conduz a expressão Nodal na parte da sequência primitiva que se diferenciará no nó (também referido como o nó primitivo). O PEE liga a expressão Nodal em resposta a uma combinação de sinalização Wnt mais um segundo sinal desconhecido; assim, um membro da família de fatores de transcrição LEF/TCF provavelmente se liga a um local de ligação TCF nas células do nó., A difusão de Nodal longe do nó forma um gradiente que então modela o eixo anterior-posterior do embrião. O ASE é um potenciador intrónico ligado pelo factor Fox1 da transcrição do domínio da cabeça do garfo. No início do desenvolvimento, a expressão Nodal focada na Fox1 estabelece o endoderma visceral. Mais tarde, em desenvolvimento, a Fox1 se liga à expressão Nodal do lado esquerdo do mesoderme lateral da placa, estabelecendo assim a assimetria esquerda-direita necessária para o desenvolvimento de órgãos assimétricos no mesoderme.,estabelecer três camadas germinativas durante a gastrulação é outro passo crítico no desenvolvimento animal. Cada uma das três camadas germinativas tem padrões únicos de expressão genética que promovem a sua diferenciação e desenvolvimento. O endoderme é especificado no início do desenvolvimento pela expressão Gata4, e Gata4 passa a dirigir a morfogénese intestinal mais tarde. A expressão Gata4 é controlada no embrião inicial por um potenciador intrónico que se liga a outro factor de transcrição do domínio de forkhead, FoxA2., Inicialmente, o potenciador impulsiona a expressão genética ampla em todo o embrião, mas a expressão rapidamente se torna restrita ao endoderma, sugerindo que outros repressores podem estar envolvidos em sua restrição. No final do desenvolvimento, o mesmo potenciador restringe a expressão aos tecidos que se tornarão o estômago e pâncreas. Um potenciador adicional é responsável pela manutenção da expressão Gata4 no endoderme durante os estágios intermédios do desenvolvimento intestinal.,
vários potenciadores promovem o desenvolvimento robustnessEdit
alguns genes envolvidos em processos críticos de desenvolvimento contêm vários potenciadores de função sobreposta. Realçadores secundários, ou” realçadores de sombra”, podem ser encontrados muitos kilobases de distância do potenciador primário (“primário” geralmente se refere ao primeiro potenciador descoberto, que é muitas vezes mais próximo do gene que regula). Por si só, cada potenciador dirige padrões quase idênticos de expressão genética. Os dois intensificadores são mesmo redundantes?, Trabalhos recentes mostraram que vários realçadores permitem que moscas da fruta sobrevivam a perturbações ambientais, tais como um aumento na temperatura. Quando elevado a uma temperatura elevada, um único potenciador às vezes não consegue conduzir o padrão completo de expressão, enquanto a presença de ambos os potenciadores permite a expressão genética normal.