o que é RNA-seq?
RNA-seq (sequenciação de RNA) é uma técnica que pode examinar a quantidade e sequências de RNA em uma amostra usando sequenciação de próxima geração (NGS). Analisa a transcriptoma dos padrões de expressão genética codificados dentro do nosso ARN. Aqui, nós olhamos por que RNA-seq é útil, como a técnica funciona, e o protocolo básico que é comumente usado today1.
quais são as aplicações de RNA-seq?,
RNA-seq permite investigar e descobrir o transcriptoma, o conteúdo celular total de RNAs incluindo mRNA, rRNA e tRNA. Compreender o transcriptoma é fundamental se quisermos conectar a informação sobre o nosso genoma com a sua expressão proteica funcional. RNA-seq pode nos dizer quais genes são ativados em uma célula, Qual é o seu nível de expressão, e em que horas eles são ativados ou desligados2. Isso permite que os cientistas compreendam mais profundamente a biologia de uma célula e avaliem as mudanças que podem indicar a doença., Algumas das técnicas mais populares que usam RNA-seq são o perfil transcritional, identificação SNP, edição de RNA e análise de expressão diferencial do gene 3.isso pode dar aos pesquisadores informações vitais sobre a função dos genes. Por exemplo, o transcriptoma pode destacar todos os tecidos em que um gene de função desconhecida é expresso, o que pode indicar qual é o seu papel. Ele também captura informações sobre eventos de splicing alternativos (Figura 1), que produzem diferentes transcrições de uma única sequência genética. Estes eventos não seriam captados pela sequenciação do ADN., Ele também pode identificar modificações pós-transcritionais que ocorrem durante o processamento de mRNA, tais como poliadenilação e capping2 5′.
Figura 1: os dados RNA-seq utilizam leituras curtas do ARNm, que está isento de ADN intrónico não codificante. Estas leituras devem então ser alinhadas de volta ao genoma de referência. como funciona o RNA-seq?
as primeiras técnicas de RNA-seq usavam a tecnologia de sequenciamento de Sanger, uma técnica que, embora inovadora na época, também era de baixo rendimento, dispendiosa e imprecisa., Só recentemente, com o advento e a proliferação da tecnologia NGS, conseguimos tirar pleno partido do potencial RNA-seq4.o primeiro passo na técnica envolve a conversão da população de RNA para ser sequenciada em fragmentos cDNA (uma biblioteca cDNA). Isto permite que o RNA seja colocado em um fluxo de trabalho NGS. Adaptadores são então adicionados a cada extremidade dos fragmentos. Estes adaptadores contêm elementos funcionais que permitem a sequenciação; por exemplo, o elemento de amplificação e o local de sequenciamento primário., A biblioteca cDNA é então analisada por NGS, produzindo sequências curtas que correspondem a uma ou ambas as extremidades do fragmento. A profundidade a que a Biblioteca é sequenciada varia dependendo das técnicas para as quais os dados de saída serão usados. A sequenciação geralmente segue métodos de sequenciação de leitura única ou emparelhados. Sequenciamento de leitura única é uma técnica mais barata e mais rápida (para referência, cerca de 1% do custo da sequenciação de Sanger) que sequencia o cDNA de apenas uma extremidade, enquanto a sequência de métodos emparelhados de ambas as extremidades, e são,portanto, mais caros e consumindo tempo 5, 6., deve ser feita outra escolha entre protocolos específicos e protocolos não específicos. O primeiro método significa que a informação sobre a qual a cadeia de ADN foi transcrita é mantida. O valor da informação extra obtida a partir de protocolos específicos da strand faz deles a opção favorável. estas leituras, das quais haverá muitos milhões até o final do fluxo de trabalho, podem então ser alinhadas a um genoma de referência e montadas para produzir um mapa de sequência de RNA que abrange a transcriptome7.,
RNA-seq vs microarrays: Por RNA-seq é considerado superior
RNA-seq é amplamente considerado como superior a outras tecnologias, tais como microarray de hibridação. Há várias razões para o estado bem-considerado de RNA-seq
uma preparação RNA-seq protocolexperimental
Antes de iniciar o seu experimento RNA-seq é essencial. Perguntas a responder antes de iniciar include10:
•Que método de purificação de RNA está a utilizar?
•de quantas leituras necessita?
•Que plataforma irá utilizar?,
•que genoma de referência irá utilizar?como avalia a qualidade do seu ARN?precisa de enriquecer o ARN-alvo?
•irá codificar o seu RNA?tenho replicados biológicos e técnicos suficientes?sequência de leitura única ou emparelhada?
cDNA Library Preparation
After these points have been considered, you can start preparing your cDNA library. Isso requererá a adição das “sequências adaptadoras” específicas da plataforma e a amplificação do DNA, mas o procedimento exato será muito específico para a plataforma usada nesta fase., A amplificação do DNA envolve uma primeira síntese de cadeia mediada pela transcriptase reversa seguida por um sintetizador de segunda cadeia mediada pela DNA polimerase10,11.uma vez que a biblioteca esteja preparada, e Adaptadores adicionados, você pode usar sua plataforma de sequenciamento escolhida para sequenciar sua biblioteca de cDNA à profundidade desejada. Uma vez que seus dados de transcrição tenham sido produzidos, você pode mapear os dados para o seu genoma de referência., O processo de alinhamento pode ser complicado pela presença de variantes e modificações, e a escolha do genoma de referência utilizado também variará o quão difícil esta fase é. Pacotes de Software como STAR são úteis nesta fase, assim como ferramentas de controle de qualidade como Picard ou Qualimap12.
RNA-Seq Data Analysis
After the alignment stage, you can focus on analyzing your data. Ferramentas como Sailfish, RSEM e BitSeq12 irão ajudá-lo a quantificar os seus níveis de expressão, enquanto ferramentas como MISO, que quantifica genes alternativamente esplicados, estão disponíveis para uma análise mais especializada13., Há uma biblioteca destas ferramentas lá fora, e ler opiniões e resumos são a sua melhor maneira de encontrar a ferramenta certa para a sua pesquisa.
Para resumir, o RNA-seq moderno é bem estabelecido como a opção superior aos microarrays e provavelmente continuará a ser a opção preferida por enquanto. 5.https://systemsbiology.columbia.edu/genome-sequencing-defining-your-experiment
6.https://emea.illumina.com/science/technology/next-generation-sequencing/paired-end-vs-single-read-sequencing.html
9.https://cofactorgenomics.com/advantages-rna-seq-over-microarray-technology/
10.http://bioinformatics.ucdavis.edu/docs/2015-june-workshop/_downloads/Th_MB_RNASeq_Intro.pdf
11.https://rnaseq.uoregon.edu/#library-prep-stranded-libraries