Animais
Todos os experimentos foram realizados utilizando-não-reprodutor masculino e feminino C57/B6 ratos (2-3 meses de idade). Cada sexo contribuiu para cerca de metade do número total de animais em cada experiência. Os animais foram alojados num ciclo escuro/claro de 12/12 h E tinham acesso ilimitado a alimentos e água., O uso de ratos nestas experiências foi de acordo com o guia para o cuidado e uso de animais de Laboratório e protocolos experimentais foram aprovados pela Universidade do Sul da Califórnia Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
exposição à luz
os olhos foram dilatados com 0, 5% de solução oftálmica Tropicamida, USP (AKORN) e 2, 5% de cloridrato de fenilefrina solução oftálmica, USP (AKORN). Os ratos adaptaram-se ao escuro durante a noite., Foram mantidos na escuridão ou expostos a uma luz fluorescente branca e fria difusa a um nível de luminescência de 5000 lux durante 30 minutos a 1 h antes de serem eutanasiados. Escuro-adaptado de amostras para ambos os métodos foram preparadas em um quarto escuro sob a luz infravermelha e todos os procedimentos que envolvam adaptados à escuridão tecido foram realizadas utilizando-se um microscópio de dissecação equipados com infravermelho conversores (B. E. Meyers & Co, Inc.). As amostras expostas à luz foram processadas sob um escopo de dissecação na luz da sala.,os ratinhos foram eutanasiados por inalação isoflurano seguida de luxação cervical. Os olhos foram enucleados e as retinas foram isoladas numa placa de petri de 35 × 10 mm, cheia com o tampão/solução adequado descrito a seguir. A córnea, lente e humor vítreo foram removidos de cada olho e o epitélio pigmentado retiniano (RPE) e sclera foram cuidadosamente descascados para longe de cada retina. As retinas isoladas foram hemisectadas com um bisturi de penas em um prato de 60 × 15 mm e as bordas foram aparadas para gerar dois retângulos., A minimização da curvatura de cada retina reduzida a metade ajudou a achatar a retina e garantiu uma casca precisa de camadas retinianas. A limpeza adequada das bordas dobráveis da retina é essencial: se a retina tiver bordas dobráveis quando colocada no papel de filtro, resultará numa diminuição do rendimento de ROS isolados e, mais importante, estará contaminada com outras camadas da retina.
imunocitoquímica
antes da enucleação, o pólo superior da córnea foi marcado por cauterização e a córnea, lente e vítreo foram posteriormente removidos., Os restantes copos oculares foram colocados em 4% de paraformaldeído em PBS durante 15 minutos e enxaguados 3 vezes durante 10 minutos em PBS. Os copos oculares foram crioproteccionados em 30% de sacarose em PBS por 2 h, colocados no composto tecidual-Teck® O. C. T. (Sakura Finetek, EUA) e rapidamente congelados em N2 líquido. Os blocos congelados foram seccionados a 10 µm em um criostato (CM 3050 S, Leica Microsystems) e armazenados em -80 °C. antes da incubação de anticorpos, as seções foram equilibradas à temperatura ambiente (RT) por 15 minutos., Para GNAT1 coloração usando o TF-15 anticorpo monoclonal de rato, epítopo de recuperação foi realizado: seções foram tratados durante 2 min RT com 0,02 mg/ml de proteinase K em tampão de bloqueio (2% de albumina de soro de bovino, 2% de soro de cabra, de 0,3% Triton X-100 em PBS 1X) e aquecida a 65 °C por 10 s), seguido de cinco lavagens com PBS. Tampão de bloqueio, em seguida, foi aplicada a todas as secções de 1 h. As secções foram incubadas com o anticorpo de coelho contra ARR1 (C10C10 diluído 1:100 em tampão de bloqueio) ou TF-15 (CytoSignal, diluído 1:200 em tampão de bloqueio)., As secções foram enxaguadas e incubadas com um anticorpo secundário marcado com fluoresceína (laboratórios Vectores). Todas as secções foram então duplamente manchadas com o anticorpo biotinilado contra a rhodopsina (1D4 diluído 1:300 em tampão de bloqueio). As secções foram enxaguadas e incubadas com rhodamine Avidin D (1:100, laboratórios vetoriais). Imagens foram obtidas usando um microscópio AxioPlan2 de Zeiss. As condições de luz e escuridão foram fotografadas usando tempos de exposição idênticos.,o método de descamação do papel de filtro foi adaptado a partir de uma técnica para expor as células bipolares marcadas com fluorescência numa montagem plana da retina para gravações por grampo . Retirar as múltiplas camadas da célula fotorreceptora com papel de filtro expõe gradualmente os dendritos das células bipolares e os corpos das células para um acesso mais fácil para a estimulação elétrica e leituras do grampo. Descobrimos que os subprodutos descascados, as camadas fotorreceptoras que estão presas no papel de filtro, eram amenizáveis para análises Western blot subseqüentes.,o meio de Ames foi utilizado para a manipulação de tecido vivo da retina (Sigma-Aldrich A1420). Foram preparados dois tampões diferentes: Ames ‘ – HEPES (a 1 L adicionar 2,38 g de HEPES, 0,877 g de NaCl, pH 7.4) e bicarbonato de Ames (a 1 L adicionar 1,9 g de NaHCO3, pH 7.4). Ambos foram preparados com antecedência, filtrados estéreis e armazenados a 4 °C. Todos os procedimentos foram realizados na TR., Antes da dissecação da retina, borbulharam-se 50-100 mL de Hepes de Ames com 100% de O2 num frasco Mediano GibcoTM de 100 mL (termo Fisher, EUA) e 50-100 mL de bicarbonato de Ames borbulharam-se com 95% de O2 e 5% de CO2 num recipiente hermético durante 15-20 minutos antes da utilização.
Retinas foram preparadas conforme descrito na secção “dissecação da Retina” e armazenadas num recipiente à prova de luz, com bicarbonato de Ames borbulhado com 95% de O2 e 5% de CO2 para manter o pH fisiológico., Esta condição de incubação é idêntica à utilizada pelos fisiologistas da retina para gravações de eletroretinogramas ex vivo ou gravações de eletrodos de sucção , e pode manter a viabilidade e funcionalidade dos tecidos por várias horas. Para cada procedimento de descasque foi utilizada uma retina retangular aparada por metade. O tecido foi transferido através de uma pipeta de transferência plástica de 1, 7 mL (Corte na ponta) para uma placa de Petri de 35 × 10 mm contendo Ames’-HEPES oxigenados. A mídia foi atualizada a cada 10 minutos durante o processo de descasque para manter o estado oxigenado., A solução de retina foi orientada com o lado do fotorreceptor virado para baixo utilizando pinças e a pipeta de transferência. Um pedaço rectangular de papel de filtro de 5 mm × 2,5 mm cortado a partir de papel de filtro VWR grau 413 (diâmetro 5,5 cm, Dimensão dos poros 5 µm, VWR, EUA) foi colocado na placa de petri ao lado da retina. A retina foi cuidadosamente movida com pinças (ligeiramente segurando as bordas) para o papel de filtro com o fotorreceptor para baixo. Uma vez que a retina estava centrada no papel de filtro, ambos foram cuidadosamente retirados do Ames’-HEPES., O lado inferior do papel de filtro (o lado sem a retina) foi marcado em papel toalha para absorver o líquido no papel de filtro (2-3 dabs). Isto criou uma aderência segura entre as células fotorreceptoras e as fibras do papel de filtro, e este acessório foi importante para remover a camada ROS. Uma gota de Ames’-HEPES da placa de petri foi colocada na retina, e o papel filtro blotou novamente na toalha de papel. Isto foi repetido um total de três vezes., O papel de filtro com retina foi então colocado de volta na placa de petri e submerso, e o tecido removido do papel de filtro com pinças. O cuidado foi tomado para tocar apenas no perímetro extremo da retina para preservar a integridade estrutural da retina. Para facilitar o processo de descasque, as bordas da retina foram cuidadosamente removidas do papel de filtro de cada lado, afrouxando a aderência da retina ao papel de filtro., Uma vez que a retina foi removida do papel de filtro, a superfície inferior do papel de filtro foi blotada em uma toalha de papel e colocada em um tubo etiquetado +ROS e foi mantida em gelo. O processo de descasque descrito acima foi repetido aproximadamente 7-8 vezes. Depois de 5 cascas, a retina tornou-se mais fina, mais transparente, e era propensa a rasgar. Após o descasque, o tubo +ROS contendo os papéis de filtro recolhidos e a retina descascada restante foi colocada para metade no tubo-ROS, congelada em gelo seco e armazenada a -80 ° C.,este método foi adaptado do descrito por M. E. Guido, et al. , who designed a ScotchTM tape peeling method that utilized lyophilized chick retinas to selectively separate the retina into different layers (photoreceptor cells, inner nuclear layer, and ganglion cells)., Uma vez que retinas de diferentes modelos animais têm diferentes distribuições de varas e cones e podem separar assimetricamente com fita após a liofilização, adaptamos este método e exploramos sua utilidade para a separação de compartimentos de varas de retinas de ratos.
liofilização de retinas isoladas
Retinas foram preparadas conforme descrito na secção “dissecação da retina”. Cold Ringer (130 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 2,4 mM MgCl2, 1,2 mM CaCl2, 10 mM HEPES, 0,02 mM EDTA, pH 7.4) foi usado durante a dissecação. Podem também ser utilizados outros tampões fisiológicos, tais como Ames’-HEPES., Como várias amostras foram frequentemente manuseadas ao mesmo tempo, os pedaços de papel de filtro de 5 × 2,5 mm (Papel de filtro qualitativo Whatman® Grau 1 (Diâmetro 9 cm, Tamanho de poro 11 µm, GE Healthcare, EUA) foram rotulados antes de serem colocados em uma placa de petri cheia de tampão de Ringer frio. Para cada amostra, posicionou-se no papel de filtro Uma peça retina rectangular com metade, utilizando um tubo de transferência de 1,7 mL (ponta cortada), com o lado da célula ganglionado para baixo e o segmento exterior do fotorreceptor para cima., Uma vez que o tecido foi centrada no papel de filtro, ambos foram retiradas da Campainha do buffer e a parte inferior do papel de filtro (o lado sem retina sobre ele), foi destruído em uma toalha de papel (2-3 dabs) para facilitar a fixação da camada de células ganglionares para o papel de filtro. Uma gota de Ringer frio foi colocada na retina, e a parte inferior do papel de filtro foi novamente blotada na toalha de papel. Isto foi repetido um total de três vezes. O buffer de Ringer foi trocado por novo buffer de Ringer frio após cada preparação da amostra., O papel de filtro com retina anexada foi colocado em uma placa de petri cheia de Ringer fria até que todas as amostras foram processadas da mesma forma. Finalmente, cada um foi novamente retirado da solução, o fundo do papel de filtro secado, e uma gota de PBS frio colocado no papel de filtro ao lado da retina, o fundo do filtro novamente blotado, e colocado em uma placa de petri limpa e seca de 35 × 10 mm. O objetivo desta etapa foi enxaguar o Ringer mais complexo com PBS para reduzir a quantidade de sal seco no tecido liofilizado., Depois de todas as amostras de tecido terem sido processadas com este passo final de lavagem e coletadas na placa de petri limpa, a placa foi embrulhada luz apertado com duas camadas de 2,5 × 2,5 polegadas quadrados de folha de alumínio, com pequenos furos, de modo que as amostras de retina adaptado ao escuro não são expostos à luz, e rapidamente congelado em N2 líquido. Os pequenos buracos permitiram acesso líquido N2 para o interior, enchendo a placa de petri, e cuidado foi tomado para garantir que os buracos foram deslocados de modo que a placa de petri foi embrulhado leve-apertado., A placa de petri foi então colocada num balão Labconco de 600 mL, utilizando um liofilizado VirTis Benchtop 2 K (SP Scientific, USA) durante 30 minutos para liofilizar o tecido.os tecidos liofilizados da retina foram armazenados a -80 ° C num recipiente cheio (W. A. Hammond Drierite Co, EUA) ou foram isolados como +ROS, +RIS, e-ROS/RIS-depauperado tissue (-OIS), congelados novamente como acima ou processados para blots ocidentais no mesmo dia. Todos os procedimentos de descasque foram realizados sob a luz do quarto. Tiras menores que 2.,Foram cortados 5 mm de largura e colocados no rebordo do dispensador de fita até serem aparados em peças rectangulares. Uma retina liofilizada fixada ao papel de filtro Whatman® foi colocada numa placa de petri limpa de 10 cm. Uma pequena peça retangular de fita ScotchTM (ligeiramente maior que a superfície do tecido) foi cortada e cuidadosamente colocada em cima da retina liofilizada. Colocar a fita em cima da retina liofilizada foi quase suficiente para anexar a camada Ros cor-de-laranja à fita., Para garantir o contato completo da ROS com a fita, pressão ligeira foi aplicada com pinças para o topo da fita para garantir o contato com a superfície superior. Depois de cuidadosamente descascar a fita, a camada Ros cor-de-laranja foi aderida à fita e separada do resto da retina. Esta fração foi rotulada +ROS e colocada em um tubo de microfuge limpo. Muitas vezes, uma película fina e branca era visível na superfície fracturada da camada laranja na primeira casca de fita., Esta superfície foi removida por mais cascas de fita até que foi completamente removida e a cor Laranja da camada ROS foi trazida para a superfície. Esta camada branca inicialmente ligada à ROS foi colocada num tubo separado e rotulada como fracção +RIS. A fita foi usada para remover o tecido retiniano remanescente do papel de filtro e foi colocada em um tubo rotulado-OIS., A quantidade de pressão aplicada a fita para o processo inicial de casca de laranja colorido de ROS camada afetada como o liofilizado exemplo fracionado; um excesso de pressão causado todo o liofilizado retina descolar o papel de filtro para a fita e muito pouco de pressão não separar o topo de laranja camada da retina. Um par de passes sobre a fita usando pressão mínima com pinças foi útil em sentir para fora a quantidade mínima e máxima de pressão para adicionar ao topo da fita.,os tubos + ROS contendo os papéis filtrantes foram submetidos a uma rotação rápida num microcentrifugador durante 2 s e o excesso de líquido removido. Cada tubo foi processado individualmente (uma retina com metade) ou dois tubos (duas retinas com metade) foram combinados para material mais concentrado. O isolado + ROS num único tubo foi homogeneizado em 45-60 µL de tampão RIPA a frio (50 mM Tris–HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% deoxicolato de sódio, 0, 1% SDS, 1 mM EDTA, 0.,1 M PMSF, mini inibidor completo da protease (Roche Applied Sciences)) e isolado de-ROS num único tubo foi homogeneizado em 80-100 µL de tampão RIPA. Quando dois tubos foram combinados, 80-110 µL de tampão Ripa a frio foi usado para homogeneizar +ROS e 100-150 µL de tampão frio foi usado para-ROS. Todos os tubos foram homogeneizados durante 1 minuto com um pilão autoclavado. Grande cuidado foi tomado para se certificar de que os pedaços de papel filtro nos tubos +ROS foram mantidos no lado dos tubos e permaneceu em contato com o pilão em vez de ser preso no fundo., Após a homogeneização, pinças estéreis foram usadas para mover os pedaços de papel de filtro para o lado do tubo +ROS, seguido de 2-4 s de rotação no microcentrifuge. Este spin extraiu o líquido do papel, e o líquido foi transferido para um tubo limpo e processado para Western blot como descrito abaixo. Este foi o passo mais demorado, e se não executado corretamente, grande parte da amostra pode acabar sendo absorvida pelos pedaços de papel de filtro. Para maximizar a recuperação da amostra, o tamanho das peças de papel filtrante utilizadas para as cascas deve ser aparado para corresponder à área do tecido retiniano.,preparação da amostra: foram combinados dois tubos, cada um contendo uma camada descascada de meia retina, para aumentar a concentração de proteínas. As amostras de +ROS e + RIS foram homogeneizadas em 100-115 µL, e-OIS em 125 µL de tampão RIPA a frio. Todos os tubos foram homogeneizados durante 1 minuto. Grande cuidado foi tomado para ter certeza de que a fita no +ROS, +RIS, e-OIS tubos permaneceram em contato com o pilão e que a fita foi mantida no lado dos tubos em vez de ser preso no fundo., Após a homogeneização, pinças esterilizadas foram usadas para Mover pedaços de fita para o lado dos tubos. Os tubos foram rodados na mini centrifugadora por 2-4 s, após o que as peças secas de fita foram cuidadosamente removidas.a quantificação das proteínas, a electroforese em gel e os imunoblots proteicos
a BCA protein assay kit (Thermo Scientific, USA) foi utilizada para determinar a quantidade total de proteínas em cada amostra. Dois microlitros de DNaseI (10 unidades/µL, Roche, Suíça) foram adicionados às amostras e foram deixados à temperatura ambiente durante 30 minutos., Adicionou-se ao homogenato o volume adequado de tampão de amostra de 4X SDS (40% glicerol, 240 mM de base Tris pH 6,8, 8% SDS, 5% ßME, 0, 04% azul de bromofenol).,tr>
Approximately 10 μg of protein lysate was loaded per lane and separated on a pre-cast polyacrylamide Bis-Tris gel with a 4–12% gradient (Life Technologies, USA) and transferred onto nitrocellulose membrane., As membranas foram bloqueadas em 10% de leite/TBS-T buffer para 1 h no RT, e incubadas durante a noite com os seguintes anticorpos: coelho anti-ARR1 de anticorpos (1:1000, ref), o mouse anti-GNAT1 anticorpo monoclonal (TF-15, 1:1000, CytoSignal), de coelho anti-β-actina de anticorpos (1:5000, GeneTex Inc.), anticorpo anti-RGS9 do coelho (1:1000), anti-Gß5L/S do coelho (CT215) (1:2000) e anticorpo policlonal anti-citocromo C do coelho (1: 500, Santa Cruz, sc-7159). As membranas foram incubadas com anticorpos secundários fluorescentes (1: 10 000, Biociências LI-COR)na TR durante 1 h., As bandas proteicas foram detectadas pelo sistema de imagem infravermelha Odyssey® (Biosciences LI-COR, EUA) e a intensidade de fluorescência de bandas individuais foi quantificada através do ImageJ. Os sinais GNAT1, ARR1 e RGS9 foram normalizados contra gß5l para +ROS, +RIS samples, e contra actin para-ROS e-OIS samples. Para cada experimento independente, sinais fluorescentes para cada proteína em cada compartimento também foram normalizados contra sinais combinados de todos os compartimentos da retina. Testes T de duas caudas não emparelhados foram usados para determinar diferenças entre dois grupos.