ARN ribozomal 16S

gena ARNr 16S este utilizată pentru studii filogenetice, deoarece este foarte conservată între diferite specii de bacterii și arhaea. Carl Woese (1977) pionier această utilizare a 16S rRNA. Se sugerează că gena 16S rRNA poate fi utilizată ca un ceas molecular fiabil, deoarece secvențele 16S rRNA din liniile bacteriene îndepărtate sunt demonstrate că au funcționalități similare. Unele termofile archaea (de exemplu, pentru Thermoproteales) conține gene pentru arnr 16S introni, care sunt situate în foarte regiunilor conservate și pot avea impact asupra recoacere de „universal” grunduri., ARNr mitocondrial și cloroplastic sunt, de asemenea, amplificate.cea mai comună pereche de grunduri a fost concepută de Weisburg și colab. (1991) și în prezent este menționată ca 27F și 1492R; cu toate acestea, pentru unele aplicații mai scurt ampliconilor poate fi necesar, de exemplu pentru 454 de secvențiere cu titan chimie grund pereche 27F-534R acoperă V1 la V3.Adesea, 8F este folosit mai degrabă decât 27F.cei doi primeri sunt aproape identici, dar 27F are un M în loc de C. AGAGTTTGATCMTGGCTCAG comparativ cu 8F.,

PCR and NGS applicationsEdit

In addition to highly conserved primer binding sites, 16S rRNA gene sequences contain hypervariable regions that can provide species-specific signature sequences useful for identification of bacteria.,Ca rezultat, secvențierea genelor rRNA 16S a devenit predominantă în microbiologia medicală ca o alternativă rapidă și ieftină la metodele fenotipice de identificare bacteriană. Deși a fost inițial folosit pentru a identifica bacterii, 16 secvențiere a fost ulterior dovedit a fi capabil de reclasificare bacterii în complet noi specii sau chiar genuri.Acesta a fost, de asemenea, folosit pentru a descrie specii noi, care nu au fost cultivate cu succes.,Odată cu secvențierea de a treia generație care vine în multe laboratoare, identificarea simultană a mii de secvențe rRNA 16S este posibilă în câteva ore, permițând studii metagenomice, de exemplu ale florei intestinale.

Hypervariable regionsEdit

bacteriene 16 gene conține nouă hypervariable regiuni (V1–V9), variind de la 30 la 100 de perechi de baze lung, care sunt implicate în structura secundară a mici subunități ribozomale., Gradul de conservare variază foarte mult între regiunile hipervariabile, regiunile mai conservate corelându-se cu taxonomia de nivel superior și regiunile mai puțin conservate la niveluri mai scăzute, cum ar fi genul și speciile. În timp ce întreaga secvență 16S permite compararea tuturor regiunilor hipervariabile, la aproximativ 1.500 de perechi de baze lungi, poate fi prohibitiv de costisitoare pentru studiile care încearcă să identifice sau să caracterizeze diverse comunități bacteriene., Aceste studii frecvent utiliza Illumina platforma, care produce citește la prețurile de 50 de ori și de 12.000 de ori mai puțin costisitoare decât 454 pyrosequencing și secvențiere Sanger, respectiv. În timp ce mai ieftin și care să permită mai adânc comunitate de acoperire, Illuminati secvențiere produce doar citește 75-250 perechi de baze timp (până la 300 de perechi de bază cu Illuminati MiSeq), și nu a stabilit protocolul de fiabil asamblarea completă a genei în comunitate probe. Regiunile hipervariabile complete pot fi asamblate dintr-o singură rulare Illumina, ceea ce le face ținte ideale pentru platformă.,în timp ce regiunile hipervariabile 16S pot varia dramatic între bacterii, gena 16S în ansamblu menține o omogenitate mai mare a lungimii decât omologul său eucariot (ARN ribozomal 18S), ceea ce poate face alinierea mai ușoară. În plus, gena 16S conține secvențe foarte conservate între regiunile hipervariabile, permițând proiectarea primerilor universali care pot produce în mod fiabil aceleași secțiuni ale secvenței 16S în diferite taxoni. Deși nicio regiune hipervariabilă nu poate clasifica cu exactitate toate bacteriile de la domeniu la specie, unele pot prezice în mod fiabil niveluri taxonomice specifice., Multe studii comunitare Selectează regiuni hipervariabile semi-conservate, cum ar fi V4, din acest motiv, deoarece poate oferi rezoluție la nivelul filumului la fel de exact ca gena completă 16S. În timp ce regiunile mai puțin conservate se luptă să clasifice specii noi atunci când taxonomia de ordin superior nu este cunoscută, ele sunt adesea folosite pentru a detecta prezența agenților patogeni specifici. Într-un studiu realizat de Chakravorty și colab. în 2007, autorii au caracterizat regiunile V1-V8 ale unei varietăți de agenți patogeni pentru a determina care regiuni hipervariabile ar fi cele mai utile pentru a include pentru teste specifice bolii și largi., Printre alte constatări, ei au remarcat că regiunea V3 a fost cea mai bună la identificarea genului pentru toți agenții patogeni testați și că V6 a fost cea mai precisă la diferențierea speciilor între toți agenții patogeni urmăriți de CDC testați, inclusiv antraxul.în timp ce analiza regiunii hipervariabile 16S este un instrument puternic pentru studiile taxonomice bacteriene, se luptă să diferențieze între speciile strâns legate. În familiile Enterobacteriaceae, Clostridiaceae și Peptostreptococcaceae, speciile pot împărtăși similitudinea secvenței de până la 99% pe întreaga genă 16S., Ca rezultat, secvențele V4 pot diferi cu doar câteva nucleotide, lăsând bazele de date de referință incapabile să clasifice în mod fiabil aceste bacterii la niveluri taxonomice mai scăzute. Prin limitarea analizei 16S pentru a selecta regiuni hipervariabile, aceste studii pot să nu observe diferențele dintre taxonii strâns legați și să le grupeze în unități taxonomice unice, subestimând astfel diversitatea totală a eșantionului. Mai mult, genomii bacterieni pot găzdui mai multe gene 16S, regiunile V1, V2 și V6 conținând cea mai mare diversitate intraspecifică., Deși nu este cea mai precisă metodă de clasificare a speciilor bacteriene, analiza regiunilor hipervariabile rămâne unul dintre cele mai utile instrumente disponibile pentru studiile comunitare bacteriene.