ce este ARN-seq?
ARN-seq (ARN-sequencing) este o tehnică care poate examina cantitatea și secvențele de ARN dintr-o probă folosind secvențierea de generație următoare (NGS). Analizează transcriptomul tiparelor de expresie genetică codificate în ARN-ul nostru. Aici, ne uităm la motivul pentru care ARN-seq este util, cum funcționează tehnica și protocolul de bază care este utilizat în mod obișnuit astăzi1.
care sunt aplicațiile ARN-seq?,
ARN-seq ne permite să investigăm și să descoperim transcriptomul, conținutul celular total al ARNr, inclusiv ARNm, ARNr și Tarn. Înțelegerea transcriptomului este esențială dacă vrem să conectăm informațiile din genomul nostru cu expresia sa proteică funcțională. ARN-seq ne poate spune care gene sunt activate într-o celulă, care este nivelul lor de exprimare și în ce momente sunt activate sau oprite2. Acest lucru permite oamenilor de știință să înțeleagă mai profund biologia unei celule și să evalueze modificările care pot indica boala., Unele dintre cele mai populare tehnici care utilizează ARN-seq sunt profilarea transcripțională, identificarea SNP, editarea ARN și analiza expresiei genelor diferențiale3.acest lucru poate oferi cercetătorilor informații vitale despre funcția genelor. De exemplu, transcriptomul poate evidenția toate țesuturile în care este exprimată o genă cu funcție necunoscută, ceea ce ar putea indica rolul acesteia. De asemenea, captează informații despre evenimente alternative de îmbinare (Figura 1), care produc transcrieri diferite dintr-o singură secvență genică. Aceste evenimente nu vor fi preluate prin secvențiere ADN., De asemenea, poate identifica modificările post-transcripționale care apar în timpul procesării ARNm, cum ar fi poliadenilarea și cappingul de 5′ 2.
Figura 1: datele ARN-seq utilizează citiri scurte ale ARNm care nu conține ADN intronic necodant. Aceste citiri trebuie apoi aliniate înapoi la genomul de referință.
cum funcționează ARN-seq?
tehnicile ARN-seq timpurii au folosit tehnologia de secvențiere Sanger, o tehnică care, deși inovatoare la acea vreme, a fost de asemenea redusă, costisitoare și inexactă., Abia recent, odată cu apariția și proliferarea tehnologiei NGS, am reușit să profităm pe deplin de potențialul ARN-seq4.
primul pas în tehnica implică conversia populației de ARN care urmează să fie secvențiate în fragmente de ADNc (o bibliotecă de ADNc). Acest lucru permite ca ARN-ul să fie pus într-un flux de lucru NGS. Adaptoarele sunt apoi adăugate la fiecare capăt al fragmentelor. Aceste adaptoare conțin elemente funcționale care permit secvențierea; de exemplu, elementul de amplificare și site-ul de secvențiere primară., Biblioteca ADNc este apoi analizată de NGS, producând secvențe scurte care corespund fie unuia, fie ambelor capete ale fragmentului. Adâncimea la care este secvențiată biblioteca variază în funcție de tehnicile pentru care vor fi utilizate datele de ieșire. Secvențierea urmează adesea fie metode de secvențiere cu o singură citire, fie cu pereche. Single-citit secvențiere este mai ieftin și mai repede tehnica (pentru referință, aproximativ 1% din costul de secvențiere Sanger), care secventele de adnc doar de la un capăt, în timp asociat-end metode de ordine din ambele capete, și, prin urmare, sunt mai scumpe și de timp-consuming5,6.,
O alegere suplimentară trebuie făcută între protocoalele specifice componentelor și cele care nu sunt specifice componentelor. Metoda anterioară înseamnă că informațiile despre care a fost transcrisă ADN-ul sunt păstrate. Valoarea informațiilor suplimentare obținute din protocoalele specifice componentelor le face opțiunea favorabilă.
aceste citiri, din care vor fi multe milioane până la sfârșitul fluxului de lucru, pot fi apoi aliniate la un genom de referință și asamblate pentru a produce o hartă a secvenței ARN care se întinde pe transcriptome7.,
ARN-seq vs microarrays: de ce ARN-seq este considerat superior
ARN-SEQ este considerat superior altor tehnologii, cum ar fi hibridizarea microarray. Există mai multe motive pentru ARN-seq e bine privit de stare
Un ARN-seq protocolExperiment de Planificare
Pregătirea înainte de a începe ARN-seq experiment este esențial. Întrebări pentru a răspunde înainte de a începe include10:
•ce metodă de purificare ARN utilizați?
•de câte citiri aveți nevoie?
•ce platformă veți folosi?,
•ce genom de referință veți folosi?
•cum evaluați calitatea ARN-ului dumneavoastră?
•ai nevoie pentru a îmbogăți ARN-ul țintă?
•veți codifica ARN-ul?
• * am destule replici biologice și tehnice?
•secvențiere unică sau pereche?
Pregătirea Bibliotecii ADNc
după ce aceste puncte au fost luate în considerare, puteți începe pregătirea bibliotecii ADNc. Acest lucru va necesita adăugarea „secvențelor adaptorului” specifice platformei și amplificarea ADN-ului, dar procedura exactă va fi foarte specifică platformei utilizate în această etapă., Amplificarea ADN-ului implică o primă sinteză mediată de revers transcriptază, urmată de o sinteză mediată de ADN polimerază10,11.după ce biblioteca este pregătită și sunt adăugate adaptoare, puteți utiliza platforma de secvențiere aleasă pentru a secvenționa biblioteca cDNA la adâncimea dorită. Odată ce datele dvs. de transcriere au fost produse, puteți mapa datele la genomul dvs. de referință., Procesul de aliniere poate fi complicat prin prezența variantelor și modificărilor de îmbinare, iar alegerea genomului de referință utilizat va varia, de asemenea, cât de dificilă este această etapă. Pachetele Software precum STAR sunt utile în această etapă, la fel și instrumentele de control al calității precum Picard sau Qualimap12.
analiza datelor ARN-Seq
după etapa de aliniere, vă puteți concentra pe analizarea datelor. Instrumente, cum ar fi Sailfish, RSEM și BitSeq12 va ajuta cuantifica nivelul de exprimare, în timp instrumente, cum ar fi MISO, care cuantifică alternativ amestecat gene, sunt disponibile pentru mai specializate analysis13., Există o bibliotecă a acestor instrumente acolo, iar citirea recenziilor și a rotunjirilor este cea mai bună modalitate de a găsi instrumentul potrivit pentru cercetarea dvs.
pentru a rezuma, ARN-seq-ul modern este bine stabilit ca opțiune superioară pentru microarrays și va rămâne probabil opțiunea preferată pentru moment.
5.https://systemsbiology.columbia.edu/genome-sequencing-defining-your-experiment
6.https://emea.illumina.com/science/technology/next-generation-sequencing/paired-end-vs-single-read-sequencing.html
9.https://cofactorgenomics.com/advantages-rna-seq-over-microarray-technology/
10.http://bioinformatics.ucdavis.edu/docs/2015-june-workshop/_downloads/Th_MB_RNASeq_Intro.pdf
11.https://rnaseq.uoregon.edu/#library-prep-stranded-libraries