Diferențial migrația de holo – și apo-metaloproteine de MICROFOANE-BN-PAGE
în Timp ce nici o separare de holo- (Fe2-a transferinei (Tf)) și apo-Tf a fost observată în convențional 1D nativ (CBB G-250 gratuit)-PAGINA (Fig. 1A) și pagina SDS (Fig., 1B), interesant, am constatat că holo-și apo-Tf sunt complet separate prin intermediul MICS-BN-PAGE (Fig. 1c) (trebuie remarcat faptul că două benzi au fost observate pentru o probă apo-Tf” pură”utilizând pagina BN fără modul MICS din cauza contaminării cu ioni metalici; Fig suplimentar. S1). În SDS-PAGE,acest lucru se datorează probabil disocierii ionilor metalici de holo-forme care apar în condiții de denaturare puternică14, 15 (datele nu sunt prezentate). Acest fapt sugerează că recunoașterea electroforetică între formele holo și apo nu este disponibilă pentru metodele convenționale de pagină., Aceste rezultate implică faptul că agenții specifici de denaturare slabi, cum ar fi CBB-G 250 angajați în MICS-BN-PAGE, recunosc diferența dintre holo – și apo-metaloproteine pentru a spori separarea, pe lângă evitarea disocierii metalelor.
diferite comportamente de migrare pentru holo-și apo-forme au fost, de asemenea, observate pentru ceruloplasmin (Cp) legat cu Cu2+ (cu-Cp) și superoxid dismutază (SOD) legat cu Cu2+ și Zn2+ (Cu/Zn-SOD) prin metoda MICS-BN-PAGE (Fig. 1d,e). Apo-formele au migrat în poziții în strânsă corespondență cu greutățile lor moleculare exacte în MICS-BN-PAGE (Fig., 1: Tf, 77 kDa; Cp, 134 kDa; SOD, 32 kDa), care este utilă la identificarea proteinelor. Așa cum este descris în secțiunea Introducere, aceste constatări ne-au determinat să dezvoltăm metodologia Holo/apo conversion (HAC)-2D MICS-BN-PAGE pentru izolarea selectivă a holo-metaloproteinelor.
conceptul de conversie holo / apo 2D MICS-BN-PAGE
noua noastră metodă de pagină 2D bazată pe migrarea diferențială între Holo – și apo-metaloproteine, începe cu o etapă MICS-BN-PAGE realizată în două benzi (benzile A și B din Fig., 2, Panoul I) pentru a permite separarea holo – și apo-metaloproteinelor dintr-o probă care conține ambele forme de metaloproteină. Cele două benzi sunt apoi supuse la două tratamente diferite după separarea inițială MICS-BN-PAGE: banda A este supusă unei a doua etape MICS-BN-PAGE, dar numai după ce a fost supusă unui tratament de conversie holo/apo (Fig. 2 panel II-1); în timp ce Banda B este livrată într-o etapă de detectare a metalelor pentru a determina ionii metalici asociați cu proteinele separate (Fig. 2 Panoul II-2). Tratamentul aplicat pe banda B a fost validat anterior., De exemplu, determinarea unor ioni de metale grele (Cu2+, Fe3+, Co3+, Ni2+, Mn2+ și Cd2+), în volum mic (µL) probe la ppt și sub-ppb niveluri de această PAGINĂ metodă, fără utilizarea de o cameră curată, au fost reported21. În plus, acest tandem 1D MICROFOANE-BN-PAGE/de detectare a metalelor PAGINA metodologia dezvăluit distribuirea exactă a Cu2+ în ser uman chiar și pentru slab legată de albumine (schimbabil) Cu2+ 21, și a sugerat că periplasmic Rubrivivax gelatinosus CopI proteine extrem de implicat în cupru de rezistență este o cupru-obligatoriu protein22., Totuși, identificarea completă a proteinelor legate de metal într-o probă complexă de proteine este dificilă datorită proteinelor co-migratoare. De exemplu, acesta nu a fost pe deplin dovedit că CopI este o cupru-proteina de legare în R. gelatinosus, deși succesiunea a trei presupuse Cu-site-uri de legare: (i) un tip 1 cupru centrul prezent în multe cupredoxins cum ar fi azurin și plastocyanin, (ii) unei bogate în Histidină-N-terminal secvență și (iii) o Histidină/Metionină bogate în secvență. Proteinele legate de copii sunt prezente în multe bacterii, dar nu sunt conservate pe scară largă; de exemplu, este absent din Escherichia coli22., Până în prezent,numai proteinele R. gelatinosus și Vibrio cholerae au fost studiate și sunt implicate în rezistența Cu22, 23. În R. gelatinosus, proteina CopI este puternic exprimată în prezența Cu2+; cu toate acestea, mecanismul de detoxifiere Cu este încă necunoscut. Astfel, este necesară o metodă de izolare a metaloproteinelor din toate celelalte proteine coexistente în probele biologice complexe.
Concept de HAC-2D MICROFOANE-BN-PAGE/de detectare a metalelor PAGINA metodologie., Panoul I: 1D MICS-BN-pagina în două benzi. Banda A a fost supusă procedurii de conversie holo/apo în gel (ca în Panoul II-1), iar apoi banda A a fost supusă paginii 2D MICS-BN după conversia holo/apo (ca în Panoul III). Banda B a fost supusă paginii de detectare cu2+ și Fe3+ (ca în Panoul II-2). Electroferograma 2D este pentru un amestec de metaloproteine (holo-Tf, apo-Tf, holo-Cp și holo-SOD), în care holo-metaloproteinele din proba originală au fost izolate ca pete de pe linia diagonală (linia galbenă punctată din panoul III). Versiuni full-size ale electroforogramelor reprezentate în Fig., 2 sunt prezentate în Fig. S2.
Pentru a depăși această limitare, informațiile furnizate de 1D MICROFOANE-BN-PAGE/metal detectarea, analiza PAGINII de Banda B este augmentată prin supunerea Lane O a doua dimensiune a MICROFOANE-BN-PAGINĂ după holo/apo conversie. Pentru a efectua această analiză, banda A este mai întâi înmuiată într-o soluție de chelator metalic acid (vezi secțiunea Metode și suplimentar pentru condițiile detaliate) pentru Conversia holo/apo (Fig. 2 Panoul II-1)., În acest sens, holo-metaloproteinele sunt derivate în apo-metaloproteine fără metal în gelul din dimensiunea primei pagini. Banda a tratată este apoi livrată la cea de-a doua etapă a paginii MICS-BN cu ajutorul unui gel de agaroză fără metal (a se vedea informațiile suplimentare). În a doua etapă MICS-BN-PAGE (Fig . 2, panelul III), apo-metaloproteinele și nemetaloproteinele din eșantionul original migrează pe linia diagonală, deoarece migrarea acestor specii în a doua dimensiune a paginii este complet identică cu migrarea lor în prima dimensiune a paginii., Pe de altă parte, holo-metaloproteine din eșantionul original migra diferite distanțe în prima și a doua MICROFOANE-BN-PAGE dimensiuni, deoarece aceste proteine migrează ca holo-forme în prima dimensiune și ca apo-forme în cea de-a doua dimensiune (și de MICROFOANE-BN-PAGINA rezultate într-o altă mobilitate electroforetică pentru holo – și apo-forme de metaloproteine; vide infra). Astfel, numai holo-metaloproteinele din proba originală migrează de pe linia diagonală în a doua dimensiune, pentru a fi identificate prin MS MALDI-TOF fără nicio purificare suplimentară a proteinelor., Tipurile și cantitățile de ioni metalici legați cu metaloproteine în soluția originală de probă (cei izolați ca pete off-diagonale), pot fi determinate prin pagina de detectare a metalelor din Banda B, așa cum este descris mai sus. Prin urmare, informațiile referitoare la identificarea și distribuția speciilor de metaloproteine, împreună cu identitățile și concentrațiile ionilor metalici pe care îi leagă, sunt accesibile din această nouă metodologie HAC-2D MICS-BN-PAGE/metal detection PAGE.,izolarea selectivă a metaloproteinelor în HAC-2D MICS-BN-PAGE
pentru proof-of-concept, HAC-2D MICS-BN-PAGE/metal detection PAGE a fost demonstrată pentru un amestec de probe care conține standardele proteinei holo-Tf, apo-Tf, holo-Cp și holo-SOD (rezultând electroferograma 2D din Fig. 2, Panoul III), precum și pentru o probă de ser uman (suplimentar Fig. S3). Locurile de holo-metaloproteine care au migrat de pe linia diagonală au fost observate cu succes pentru proba mixtă de proteine., În plus, Fe3+ a fost detectat în poziția holo-Tf și Cu2+ în pozițiile holo-Cp și holo-SOD, în prima etapă MICS-BN-PAGE folosind pagina de detectare a metalelor. Dacă nu se efectuează nici o conversie holo / apo, toate proteinele migrează pe linia diagonală (Fig suplimentar. S5). Pentru o probă de ser uman, holo-Tf și holo-Cp au fost detectate cu succes (Fig suplimentar. S3)., Astfel, s-a concluzionat că HAC-2D MICS-BN-PAGE/metal detection PAGE este foarte eficient pentru izolarea holo-metaloproteinelor și identificarea ionilor metalici legați inițial de metaloproteine într-un amestec proteic.în cele din urmă, metoda HAC-2D MICS-BN-PAGE a fost aplicată unei fracții proteice solubile bacteriene totale obținute din celulele R. gelatinosus cultivate în prezența proteinei CopI de 1,2 mM Cu2+. Aceasta reprezintă o probă de proteine biologice., Pentru această probă, un punct de pe linia diagonală a fost găsit la poziția de 100 kDa și 29 kDa în prima și, respectiv, a doua pagină (Fig. 3a). O concentrație mare de Cu2+ a fost observată la poziția de 97-139 kDa în prima pagină MICS-BN (Fig. 3b). În consecință, s-a concluzionat că proteina din acest loc are un ion de Cu legat de ea. Spotul a fost tăiat și apoi analizat ulterior de MALDI-TOF MS. au fost identificate peptide corespunzătoare CopI (Fig. 3c, suplimentar Fig. S7 și tabelul S1)., În plus, atunci când acest punct de gel a fost rulat pe SDS-PAGE, a fost observată o singură bandă de proteine CopI (datele nu sunt prezentate). Un alt punct în afara liniei diagonale a fost observat la aproximativ 40 kDa (deasupra punctului 29 kDa copii în a doua dimensiune (Fig. 3a)). A fost confirmat de SM MALDI-TOF că acest spot provine și din copii (și a fost probabil un dimer al copiilor în funcție de greutatea moleculară). Astfel, o metaloproteină ar putea fi izolată în mod specific dintr-un amestec complex de proteine, identificând în același timp metalul legat., Această analiză de HAC-2D MICROFOANE-BN-PAGE cu siguranta s-a dovedit că CopI este un cupru de legare de proteine, și, interesant, că această proprietate ar putea fi legate de proteine e Cu-funcția de detoxifiere în bacteriană periplasm. Analiza cantitativă ulterioară a relevat stoichiometria ionului de Cu la CopI ca 1: 1 (pe baza concentrațiilor ionului de cu legat (1,05 µM) și a proteinei holo-CopI (0,95 µM) determinate prin colorarea CBB R-250). Acest lucru este în total de acord cu alte rezultate experimentale, care au găsit o cu: stoichiometrie copii de 1: 1.2 folosind ICP-MS cu copii pure (Durand et al.,, date nepublicate). Acest rezultat sugerează că metoda noastră este utilă și pentru investigațiile stoichiometriilor metaloproteinelor.
HAC-2D MICROFOANE-BN-PAGE angajarea de argint colorare (a), cu Cu2+ PAGINA de detecție (b), de o fracțiune solubilă obținută din R. gelatinosus celulele cultivate în prezența 1.2 mM Cu2+ (proteine totale: 31.5 µg). Punctul off-diagonal indicat de asteriscul de la (a) a fost supus MALDI-TOF MS (Fig suplimentar., S7), identificând secvențele afișate cu font roșu ca parte a secvenței CopI mature (c). Versiuni full-size ale electroforogramelor reprezentate în Fig. 3 sunt prezentate în Fig suplimentar. S8.
experimente de electroforeză capilară pentru a investiga modurile de recunoaștere moleculară
îmbunătățirea rezoluției între holo – și apo-forme în MICS-PAGE asistată cu CBB colorant (Fig., 1C-e) este o cheie importantă pentru metodologia noastră și, interesant, această recunoaștere moleculară pare să provină din diferite numere de molecule de colorant CBB G – 250 care se leagă de fiecare dintre formele Holo-vs.apo ale metaloproteinelor. Aceasta, la rândul său, duce probabil la diferite sarcini eficiente și/sau structuri sterice induse, pentru complexele colorant-proteine. Ambele efecte ar afecta mobilitatea electroforetică., Pentru a obține înțelegere mai profundă cu privire la recunoașterea mecanism de CBB G-250 obligatoriu vopsea spre holo – și apo-Tf, CE au fost efectuate experimente, împreună cu andocare simulări folosind AutoDock Vina program24,25 (vide infra). CZE se realizează în soluție apoasă liberă, fără o matrice de gel, și astfel un efect de cernere moleculară nu trebuie să fie luate în considerare în simulări. Mobilitatea electroforetică a holo-Tf măsurată prin CZE a fost în mod evident diferită de cea a apo-Tf cu adăugarea colorantului CBB (Fig. 4), în timp ce aceste proteine aveau mobilități identice în absența colorantului., Acest fapt sugerează cu tărie că numărul de molecule de colorant legate de holo – și apo-metaloproteine este diferit. În CZE, migrarea complexului proteină-colorant ar fi predominant afectată de încărcarea efectivă a complexului, care, la rândul său, ar fi afectată de numărul de molecule anionice CBB încărcate individual legate de proteină.,
Tipic electropherograms din CZE experimente pentru: 10 µM holo – sau apo-Tf fără CBB G-250 (colțul verde urmă); și amestecuri care conțin minimum 5 mM CBB G-250 vopsea cu 10 µM holo-Tf (mijloc urme albastre) sau cu 10 µM apo-Tf (mai mică roșie urmă).,
în mod Tradițional, mobilitate electroforetică a unei proteine în soluție gratuită este reprezentată de ecuația Henry, așa cum se arată în ecuația (1):
Aici, Q, η, R și k reprezintă tariful net, soluția vâscozitate, raza de proteine, și invers Debye lungime de soluție de electrolit. Funcția Henry, H, crește monoton de la 2/3 la 1., Strict vorbind, această formulă se aplică exclusiv la o moleculă sferică, cu un centrosymmetric taxa de distribuție, deși există unele discuții pentru a modifica Henry ecuația de a aplica pentru non-sferice proteine complexe taxa de distribuție (inclusiv dipol și cuadripolare)26. În cazul nostru, moleculele holo – și apo-TF sunt sfere deformate de dimensiuni foarte asemănătoare (asemănătoare sferoidelor cu lungimi lungi și scurte ale axei de aproximativ 92 și 60 Å (holo-Tf) și 93 și 68 Å (apo-Tf), respectiv) (Fig suplimentar. S9)., În plus, se așteaptă ca dipolul și quadrupolul să aibă doar un efect minor asupra mobilității, deoarece moleculele CBB G-250 legate de holo-/apo-Tf nu sunt localizate, așa cum se arată în Fig suplimentar. S9 (vezi mai jos). Rezultatele calculelor precise de Kim și colab.26 arată că mobilitate electroforetică a unei sferoidale de proteine nu este afectată în mod semnificativ de un cuadrupol în soluții de putere ionică scăzută (I < 0,01 M), și ionic puterea de separare tampon în nostru CZE experimente a fost la fel de scăzute (I = 0.013 M).,
Astfel, raportul de electroforetică mobilități de apo – și holo-Tf complexat cu CBB G-250 colorant (și anume, µApo/µHolo), este atribuită raportul dintre taxele nete din fiecare complex (și anume, QApo/QHolo), care pot fi ușor obținute din ecuația Henry. Sarcinile nete negative ale complexelor Tf-CBB G-250 provin în principal din numărul de legare al colorantului. În consecință, valoarea µApo/µHolo dă, de asemenea, raportul dintre numerele colorantului (și anume, NApo / nholo). Experimental, raportul mobilităților electroforetice ale celor două forme de Tf (µApo / µHolo = (-2.69 × 10-4)/(-2.,09 × 10-4)) s-a constatat a fi 1.29 de către CZE (Fig. 4), care corespunde raportului dintre sarcina electrică efectivă, cu condiția ca dimensiunile ambelor forme de Tf să fie similare. Prin urmare, raportul mobilităților electroforetice ar trebui să fie de acord cu raportul moleculelor de colorant legate. Cu toate acestea, este necesară o discuție suplimentară a relației dintre mobilitatea electroforetică și forma proteinei pentru alte metaloproteine în cazurile în care formele holo – și apo-proteice diferă (ca în cazul Cp).,
Molecular docking simulare de experimente pentru a investiga recunoaștere moleculară moduri
obligatoriu Vopsea a fost determinată de flexibil molecular docking simulări de AutoDock Vina27, conceput pentru a exhaustiv de căutare pentru site-uri de legare și să își calculeze energiilor libere (Fig. 5 și suplimentar Fig. S9). Recent, Wang și colab.25 a raportat că AutoDock Vina are o putere mare de notare și o putere de eșantionare intermediară în raport cu alte programe de andocare utilizate pe scară largă., Conform acestor simulări, un număr mai mare de molecule de colorant CBB G-250 legate de locurile libere de legare a Fe în apo-Tf comparativ cu holo-Tf (Fig. 5a) au fost observate. Pe baza acestor Autodock Vina simulări, raport de vopsea-obligatoriu numărul NApo/NHolo a fost găsit pentru a fi 1.23, cu o energie de legătură <-6.5 kcal/mol (corespunzător la K~104.4 M−1) (Fig. 5B pentru numărul de legare a coloranților distribuția cumulată a frecvenței în funcție de energia de legare), care este în acord cu rezultatele noastre CZE, discutate anterior (NApo/NHolo = 1.29)., Legarea cantitativă se presupune prin adăugarea colorantului la niveluri mM (peste 95% din locurile de legare interacționează cu colorantul atunci când log K este 4.4 sau mai mare), ca în aceste experimente.
numărul de legare a moleculelor de colorant cu holo-Tf a fost, de asemenea, investigat prin experimente CZE (date care nu sunt prezentate), după cum se apreciază din scăderea vârfului de colorant liber pentru o probă de colorant CBB g-250 de 1 mM, cu și fără adăugarea de holo-Tf de 10 µM., Deoarece legarea serie a fost măsurată să fie >18, obligatoriu, numărul de NHolo a fost presupus a fi >20 MG-BN-PAGE experimente (cu 3,0 mM colorant adăugat). Această legare numărul moleculelor de colorant (>20) din CZE experimente este în bună concordanță cu numărul de legat moleculele de colorant (N = 21) din molecular docking simulări care ar da naștere la prezis afinitate de -6.5 kcal/mol, și deci rezultatele noastre sunt în sistem self-consistent.,se vede din aceste simulări moleculare de andocare și experimente CZE că colorantul CBB G – 250 recunoaște diferitele structuri chimice ale holo-și apo-metaloproteinelor pentru a obține valori µ diferite. Mai multe observații detaliate ale simulat obligatoriu moduri, de asemenea, sugerează că CBB G-250 moleculă interacționează cu resturi de aminoacizi accesibil din cauza mai deschis (desfășurat), apo-Tf structura, comparativ cu mai închis (pliat) holo-Tf structură, în timp ce vopseaua prezinta nici un caracter obligatoriu direct cu Fe-obligatoriu resturi de aminoacizi (Asp392, Tyr429, Tyr517 și 585)., Astfel, se presupune că colorantul recunoaște mici diferențe între structurile chimice pliate și desfăcute ale metaloproteinelor, care sunt induse de legarea sau disocierea ionilor metalici. Astfel de diferențe mici nu pot fi identificate prin alte metode convenționale de separare.
reziduuri de aminoacizi care intră în contact cu molecula de colorant în fiecare loc de legare a colorantului în simulare (de exemplu, Fig suplimentar. S10) au fost clasificate în funcție de natura lor dominantă: sarcină hidrofobă, hidrofilă sau electrostatică (așa cum sunt rezumate în tabelul suplimentar S2 și tabelul S3)., Conform rezultatelor, populațiile fiecărui tip de aminoacid care interacționează cu moleculele de colorant nu au prezentat nicio diferență între formele holo – și apo-proteice (26-27% pentru hidrofobe, 37-40% pentru hidrofile, 33-35% pentru reziduurile încărcate în fiecare formă). Cu toate acestea, numărul legăturilor de hidrogen din apo-Tf (33 total; 1,2 pe situs de legare) a fost semnificativ mai mare decât în holo-Tf (19 total; 0,9 pe situs de legare). Atunci când se concentrează pe cele opt situsuri obligatorii din apo-Tf care nu erau prezente în holo-Tf (tabelul suplimentar S3), numărul de obligațiuni H pe sit a fost constatat a fi 2.1., Aceste rezultate sugerează cu tărie că modificările interacțiunilor legăturilor de hidrogen sunt responsabile în primul rând pentru diferențierea dintre formele holo – și apo-Tf, în timp ce ar fi necesare investigații suplimentare pentru a înțelege mecanismul complet.