dezvoltarea, diferențierea și creșterea celulelor și țesuturilor necesită modele precis reglementate de exprimare a genelor. Amplificatorii funcționează ca elemente de reglementare cis pentru a media controlul spațial și temporal al dezvoltării prin activarea transcripției în celule specifice și/sau reprimarea acesteia în alte celule. Astfel, combinația particulară a factorilor de transcripție și a altor proteine de legare a ADN-ului într-un țesut în curs de dezvoltare controlează genele care vor fi exprimate în acel țesut. Amplificatorii permit ca aceeași genă să fie utilizată în diverse procese în spațiu și timp.,
identificarea și caracterizareaedit
în mod tradițional, potențatorii au fost identificați prin tehnici de capcană enhancer folosind o genă reporter sau prin analiza secvenței comparative și genomica computațională. În modelele tractabile genetic, cum ar fi Drosophila melanogaster, de exemplu, un construct reporter, cum ar fi gena lacZ, poate fi integrat aleatoriu în genom folosind un transposon de element P. Dacă gena reporter se integrează lângă un amplificator, expresia sa va reflecta modelul de Expresie condus de acel amplificator., Astfel, colorarea muștelor pentru expresia sau activitatea LacZ și clonarea secvenței care înconjoară site-ul de integrare permite identificarea secvenței de îmbunătățire.cu toate acestea, dezvoltarea tehnologiilor genomice și epigenomice a schimbat dramatic perspectivele pentru descoperirea modulelor de reglementare cis (CRM)., Next-generation sequencing (NGS) metode permite acum high-throughput funcționale CRM descoperire teste, și mult cantități tot mai mari de date disponibile, inclusiv pe scară largă biblioteci de factor de transcriere-site-ul de legare (TFBS) motive, colecții de adnotat, validate Crm, și extinse epigenetice datele pe mai multe tipuri de celule, se face exacte de calcul CRM discovery un obiectiv realizabil. Un exemplu de abordare bazată pe NGS, numită DNase-seq, a permis identificarea regiunilor de cromatină epuizate de nucleozomi sau deschise, care pot conține CRM., Mai recent au fost dezvoltate tehnici precum ATAC-seq care necesită mai puțin material de pornire. Regiunile epuizate de nucelozomi pot fi identificate in vivo prin expresia Metilazei Dam, permițând un control mai mare al identificării potențiatorilor specifici de tip celular.Metodele computaționale includ genomica comparativă, gruparea siturilor de legare TF cunoscute sau prezise și abordările supravegheate de învățare automată instruite pe MRC cunoscute., Toate aceste metode s-au dovedit eficiente pentru descoperirea CRM, dar fiecare are propriile considerații și limitări și fiecare este supus unui număr mai mare sau mai mic de fals-pozitive identifications.In abordarea genomică comparativă, conservarea secvenței regiunilor care nu codifică pot indica amelioratori. Secvențele din mai multe specii sunt aliniate, iar regiunile conservate sunt identificate computațional., Secvențele identificate pot fi apoi atașate la o genă reporter, cum ar fi proteina fluorescentă verde sau lacZ, pentru a determina modelul in vivo al expresiei genelor produse de potențiator atunci când este injectat într-un embrion. expresia ARNm a reporterului poate fi vizualizată prin hibridizare in situ, care oferă o măsură mai directă a activității de îmbunătățire, deoarece nu este supusă complexității traducerii și plierii proteinelor., Deși multe dovezi au indicat conservarea secvenței pentru amelioratorii critici de dezvoltare, alte lucrări au arătat că funcția potențiatorilor poate fi conservată cu puțină sau deloc conservarea secvenței primare. De exemplu, amelioratorii RET la om au o conservare foarte mică a secvențelor față de cele din zebrafish, dar secvențele ambelor specii produc modele aproape identice de expresie a genelor reporter la zebrafish., În mod similar, la insectele foarte divergente (separate de aproximativ 350 de milioane de ani), s-a constatat că modelele de expresie a genelor similare ale mai multor gene cheie sunt reglementate prin MRC constituite în mod similar, deși aceste MRC nu prezintă nicio conservare apreciabilă a secvenței detectabilă prin metode standard de aliniere a secvenței, cum ar fi BLAST.
în segmentarea insecteloredit
potențatorii care determină segmentarea timpurie în embrionii Drosophila melanogaster sunt printre cei mai bine caracterizați potențatori de dezvoltare., În embrionul de zbor timpuriu, factorii de transcripție a genei gap sunt responsabili pentru activarea și reprimarea unui număr de gene de segmentare, cum ar fi genele de reguli pereche. Genele gap sunt exprimate în blocuri de-a lungul axei anterioare-posterioare a muștei împreună cu alți factori de transcripție a efectului matern, creând astfel zone în care sunt exprimate diferite combinații de factori de transcripție. Genele cu reguli pereche sunt separate una de alta prin celule care nu exprimă. Mai mult decât atât, dungile de Expresie pentru diferite gene pereche-regulă sunt compensate de câteva diametre de celule unul de altul., Astfel, combinațiile unice de expresie a genei pereche-regulă creează domenii spațiale de-a lungul axei anterioare-posterioare pentru a configura fiecare dintre cele 14 segmente individuale. Amplificatorul de 480 bp responsabil pentru conducerea benzii ascuțite două dintre gena cu reguli pereche chiar sărită (eve) a fost bine caracterizat. Amplificatorul conține 12 situsuri de legare diferite pentru factorii de transcripție a genelor materne și gap. Activarea și reprimarea site-urilor se suprapun în secvență., Eve este exprimată doar într-o bandă îngustă de celule care conțin concentrații mari de activatori și concentrație scăzută a represorilor pentru această secvență de amplificator. Alte regiuni de îmbunătățire conduc expresia eve în alte 6 dungi din embrion.
în modelarea vertebrateloredit
stabilirea axelor corpului este un pas critic în dezvoltarea animalelor. În timpul mouse-ul dezvoltării embrionare, Nodale, o transformare growth factor-beta superfamiliei ligand, este o gena-cheie implicate în structurare atât antero-posterior și axa stânga-dreapta axa embrionului., Gena nodală conține doi potențiatori: amplificatorul Proximal Epiblast (PEE) și amplificatorul asimetric (ASE). PEE este în amonte de gena nodală și conduce expresia nodală în porțiunea benzii primitive care se va diferenția în nod (denumit și nodul primitiv). PEE activează expresia nodală ca răspuns la o combinație de semnalizare Wnt plus un al doilea semnal necunoscut; astfel, un membru al familiei factorului de transcripție LEF/TCF se leagă probabil de un situs de legare TCF în celulele din nod., Difuzia nodului departe de nod formează un gradient care apoi modelează axa anterioară-posterioară extinsă a embrionului. ASE este un amplificator intronic legat de factorul de transcriere a domeniului capului furcii Fox1. La începutul dezvoltării, expresia nodală condusă de Fox1 stabilește endodermul visceral. Mai târziu în dezvoltare, legarea Fox1 la ASE conduce expresia nodală pe partea stângă a mesodermului plăcii laterale, stabilind astfel asimetria stânga-dreapta necesară dezvoltării asimetrice a organelor în mezoderm.,stabilirea a trei straturi de germeni în timpul gastrulării este un alt pas critic în dezvoltarea animalelor. Fiecare dintre cele trei straturi de germeni are modele unice de exprimare a genelor care promovează diferențierea și dezvoltarea lor. Endodermul este specificat la începutul dezvoltării prin expresia Gata4, iar Gata4 continuă să direcționeze morfogeneza intestinală mai târziu. Gata4 expresie este controlată în embrionului de un intronic potențiator de care se leagă un alt forkhead domeniu factor de transcriere, FoxA2., Inițial, enhancerul conduce o expresie genetică largă în întregul embrion, dar expresia devine rapid limitată la endoderm, sugerând că alți represori pot fi implicați în restricția sa. La sfârșitul dezvoltării, același amplificator limitează expresia țesuturilor care vor deveni stomacul și pancreasul. Un amplificator suplimentar este responsabil pentru menținerea expresiei Gata4 în endoderm în etapele intermediare ale dezvoltării intestinului.,unele gene implicate în procesele critice de dezvoltare conțin potențatori multipli ai funcției suprapuse. Secundar amelioratori, sau „umbra amelioratori”, pot fi găsite multe kilobaze departe de primar enhancer („primară” se referă de obicei la primul amplificator de descoperit, care este de multe ori mai aproape de gene se regleaza). Pe cont propriu, fiecare enhancer conduce modele aproape identice de expresie a genelor. Sunt cele două amplificatoare cu adevărat redundante?, Lucrările recente au arătat că mai mulți amelioratori permit muștelor de fructe să supraviețuiască perturbațiilor de mediu, cum ar fi o creștere a temperaturii. Când este ridicat la o temperatură ridicată, un singur amplificator nu reușește uneori să conducă modelul complet de exprimare, în timp ce prezența ambilor amplificatori permite expresia normală a genelor.