Animale
Toate experimentele au fost efectuate folosind non-crescător de sex masculin și de sex feminin C57/B6 șoareci (2-3 luni). Fiecare sex a contribuit la aproximativ jumătate din numărul total de animale din fiecare experiment. Animalele au fost adăpostite într-un ciclu de 12/12 h întuneric/lumină și au avut acces nerestricționat la hrană și apă., Utilizarea șoarecilor în aceste experimente a fost în conformitate cu Ghidul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator, iar protocoalele experimentale au fost aprobate de Comitetul instituțional pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de la Universitatea din California de Sud (IACUC).ochii au fost dilatați cu soluție oftalmică de tropicamidă 0,5%, USP (AKORN) și soluție oftalmică de clorhidrat de fenilefrină 2,5%, USP (AKORN). Șoarecii au fost adaptați la întuneric peste noapte., Acestea au fost ținute în întuneric sau expuse la o lumină fluorescentă albă rece difuză la un nivel de luminiscență de 5000 lux timp de 30 min până la 1 h înainte de a fi eutanasiate. Întuneric-adaptat probe pentru ambele metode au fost pregătite într-o cameră obscură în infraroșu și toate procedurile care implică întuneric-adaptat de țesut au fost efectuate utilizând un microscop echipat cu infraroșu convertoare (B. E. Meyers & Co, Inc.). Probele expuse la lumină au fost prelucrate într-un domeniu de disecție în lumina camerei.,
disecția retinei
șoarecii au fost eutanasiați prin inhalare de izofluran urmată de dislocarea cervicală. Ochii au fost enucleați, iar retinele au fost izolate într-un vas petri de 35 × 10 mm umplut cu tamponul/soluția corespunzătoare descrisă mai jos. Corneea, cristalinul și umoarea vitroasă au fost îndepărtate din fiecare ochi, iar epiteliul pigmentat retinian (EPR) și sclera au fost îndepărtate cu grijă de fiecare retină. Retinele izolate au fost hemisectate cu un bisturiu de pene într-un vas de 60 × 15 mm, iar marginile au fost tăiate pentru a genera două dreptunghiuri., Minimizarea curburii fiecărei retine înjumătățite asistată în aplatizarea retinei și a asigurat o coajă precisă a straturilor retiniene. Tunderea corectă a marginilor pliabile ale retinei este esențială: dacă retina are margini pliabile atunci când este plasată pe hârtia de filtru, aceasta va duce la o scădere a randamentului de ROS izolat și, mai important, va fi contaminată cu alte straturi retiniene.
Imunocitochimie
înainte de enucleare, polul superior al corneei a fost marcat de cauterizare, iar corneea, lentila și vitrosul au fost ulterior îndepărtate., Paharele de ochi rămase au fost plasate în paraformaldehidă 4% în PBS timp de 15 min și clătite de 3 ori timp de 10 min în PBS. Ochi cupe au fost cryoprotected în 30% zaharoză în PBS pentru 2 sec, plasate în Țesuturi-Teck® O. C. T. compus (Sakura Finetek, statele UNITE ale americii) și congelate rapid în N2 lichid. Blocurile congelate au fost secționate la 10 µm într-un criostat (CM 3050 s, Leica Microsystems) și depozitate la -80 °C. Înainte de incubarea anticorpilor, secțiunile au fost echilibrate la temperatura camerei (RT) timp de 15 minute., Pentru GNAT1 colorare folosind TF-15 mouse-ul anticorp monoclonal, epitop regăsire a fost efectuată de: secțiunile au fost tratate timp de 2 min RT cu 0,02 mg/ml proteinaza K într-un tampon de blocare (2% albumină serică bovină, 2% capra ser, 0.3% Triton X-100 în 1X PBS) și încălzit la 65 °C timp de 10 s, urmat de cinci clătiri cu PBS. Tampon de blocare a fost apoi aplicat la toate secțiunile pentru 1 sec. Secțiunile au fost fie incubate cu iepurele de anticorpi împotriva ARR1 (C10C10 diluat 1:100 într-un tampon de blocare) sau TF-15 (CytoSignal, diluat 1:200 în tampon de blocare)., Secțiunile au fost clătite și incubate cu un anticorp secundar marcat cu fluoresceină (laboratoare Vector). Toate secțiunile au fost apoi dublu-colorate cu biotinylated anticorpi împotriva rodopsinei (1D4 diluat 1:300 în tampon de blocare). Secțiunile au fost clătite și incubate cu rodamină Avidin D (1:100, laboratoare Vector). Imaginile au fost obținute folosind un microscop Zeiss AxioPlan2. Condițiile de lumină și întuneric au fost imaginate folosind timpi de expunere identici.,
colecția ROS prin peeling secvențial cu hârtie de filtru
metoda de peeling a hârtiei de filtru a fost adaptată dintr-o tehnică pentru a expune celulele bipolare etichetate fluorescent într-un suport plat retinian pentru înregistrări cu cleme de patch-uri . Îndepărtarea straturilor multiple ale celulei fotoreceptoare cu hârtie de filtru expune treptat dendritele celulelor bipolare și corpurile celulare pentru un acces mai ușor pentru stimularea electrică și citirile clemei de patch-uri. Am constatat că produsele secundare decojite, straturile fotoreceptoare care sunt lipite pe hârtia de filtru, au fost supuse analizelor ulterioare Western blot.,mediul Ames a fost utilizat pentru manipularea țesutului retinian viu (Sigma-Aldrich A1420). Au fost preparate două tampoane diferite: Ames ‘- HEPES (la 1 L se adaugă 2,38 G HEPES, 0,877 g NaCl, pH 7,4) și Ames’-bicarbonat (la 1 L se adaugă 1,9 g NaHCO3, pH 7,4). Ambele au fost preparate în avans, filtrate sterile și depozitate la 4 °C. Toate procedurile au fost efectuate la RT., Înainte de disecția retinei, 50-100 mL de Ames’HEPES a fost barbotat cu 100% O2 într-un flacon de 100 ml Mediu GibcoTM (Thermo Fisher, SUA) și 50-100 mL de Ames’-bicarbonat a fost barbotat cu 95% O2 și 5% CO2 într-un recipient etanș timp de 15-20 min înainte de utilizare.retinele au fost preparate conform descrierii din secțiunea „disecția retinei” și depozitate într-un recipient etanș cu bicarbonat de Ames barbotat cu 95% O2 și 5% CO2 pentru a menține pH-ul fiziologic., Această condiție de incubație este identică cu cea utilizată de fiziologii retinei pentru înregistrările electroretinogramei ex vivo sau înregistrările electrodului de aspirație și poate menține viabilitatea și funcționalitatea țesuturilor timp de câteva ore. O bucată înjumătățită de retină tăiată dreptunghiulară a fost utilizată pentru fiecare procedură de peeling. Țesutul a fost transferat printr-o pipetă de transfer din plastic de 1,7 mL (tăiată la vârf) într-un vas petri de 35 × 10 mm conținând Ames-HEPES oxigenat. Mass-media a fost reîmprospătată la fiecare 10 minute în timpul procesului de peeling pentru a menține starea oxigenată., Retina în soluție a fost orientată cu partea fotoreceptorului orientată în jos folosind penseta și pipeta de transfer. O bucată de hârtie de filtru dreptunghiulară de 5 mm × 2,5 mm tăiată din hârtie de filtru de calitate VWR 413 (diametru 5,5 cm, dimensiunea porilor 5 µm, VWR, SUA) a fost plasată în vasul petri de lângă retină. Retina a fost mutată cu grijă cu pensete (ținând ușor marginile) pe hârtia de filtru cu fotoreceptorul în jos. Odată ce retina a fost centrată pe hârtia de filtru, ambele au fost ridicate cu grijă din Ames’HEPES., Partea de jos a hârtiei de filtru (partea fără retină) a fost șters pe prosop de hârtie pentru a absorbi lichidul de pe hârtia de filtru (2-3 dabs). Aceasta a creat o aderență sigură între celulele fotoreceptoare și fibrele hârtiei de filtru, iar acest atașament a fost important pentru îndepărtarea stratului ROS. O picătură de Ames ‘ – HEPES din vasul petri a fost plasată pe retină, iar hârtia de filtru a fost ștersă din nou pe prosopul de hârtie. Acest lucru a fost repetat în total de trei ori., Hârtia de filtru cu retina a fost apoi plasată înapoi în vasul petri și scufundată, iar țesutul îndepărtat din hârtia de filtru cu pensete. S-a avut grijă să se atingă doar perimetrul extrem al retinei pentru a păstra integritatea structurală a retinei. Pentru a facilita procesul de peeling, marginile retinei au fost îndepărtate ușor de hârtia de filtru din fiecare parte, slăbind aderența retinei la hârtia de filtru., Odată ce retina a fost îndepărtată de pe hârtia de filtru, suprafața inferioară a hârtiei de filtru a fost ștersă pe un prosop de hârtie și plasată într-un tub etichetat +ROS și a fost ținută pe gheață. Procesul de peeling descris mai sus a fost repetat de aproximativ 7-8 ori. După 5 coji, retina a devenit mai subțire, mai transparentă și a fost predispusă la rupere. După decojire, tubul +ROS care conține hârtiile de filtru colectate și retina rămasă decojită în jumătate a fost plasată în tubul-ROS, înghețată pe gheață uscată și depozitată la -80 °C.,
de Separare a fotoreceptoare compartimente de peeling liofilizat retina
Această metodă a fost adaptată după cea descrisă de M. E. Guido, et al. , OMS a proiectat o metodă de peeling cu bandă ScotchTM care a utilizat retinele de pui liofilizate pentru a separa selectiv retina în diferite straturi (celule fotoreceptoare, strat nuclear interior și celule ganglionare)., Deoarece retinele de la diferite modele animale au distribuții diferite ale tijei și conului și se pot separa asimetric cu bandă după liofilizare, am adaptat această metodă și am explorat utilitatea acesteia pentru separarea compartimentelor tijei ale retinelor de șoarece.
uscarea prin congelare a retinelor izolate
retinele au fost preparate conform descrierii de la secțiunea „disecție retiniană”. În timpul disecției s-au utilizat sonerii reci (130 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 2,4 mM MgCl2, 1,2 mM CaCl2, 10 mM HEPES, 0,02 mM EDTA, pH 7,4). Alte tampoane fiziologice, cum ar fi Ames’-HEPES, ar putea fi, de asemenea, utilizate., Deoarece mai multe probe au fost adesea manipulate în același timp, bucățile de hârtie de filtru de 5 × 2,5 mm (hârtie de filtru calitativă Whatman® Grad 1 (Diametru 9 cm, dimensiunea porilor 11 µm, GE Healthcare, SUA)) au fost etichetate înainte de timp înainte de a fi introduse într-un vas petri umplut cu tampon Ringer rece. Pentru fiecare probă, o bucată de retină dreptunghiulară, înjumătățită, a fost poziționată pe hârtia de filtru folosind o pipetă de transfer de 1,7 mL (vârful tăiat) cu partea celulei ganglionare în jos și partea exterioară a segmentului fotoreceptor în sus., După ce țesutul a fost centrat pe hârtie de filtru, ambele au scos din soluție tampon și partea de jos a filtrului de hârtie (fără partea retina pe acesta) a fost șters pe un prosop de hârtie (2-3 dabs) pentru a facilita atașarea celulelor ganglionare strat pe hârtie de filtru. O picătură de sonerie rece a fost plasată pe retină, iar fundul hârtiei de filtru a fost din nou șters pe prosopul de hârtie. Acest lucru a fost repetat în total de trei ori. Tampon Ringer a fost schimbat pentru tampon nou rece Ringer după fiecare pregătire a probei., Hârtia de filtru cu retină atașată a fost plasată într-un vas petri umplut cu sonerie rece până când toate probele au fost prelucrate în același mod. În cele din urmă, fiecare a fost din nou ridicată din soluție, partea inferioară a hârtiei de filtru a fost uscată și o picătură de PBS rece plasată pe hârtia de filtru de lângă retină, partea inferioară a filtrului a fost din nou ștersă și plasată într-un vas petri curat și uscat de 35 × 10 mm. Scopul acestei etape a fost de a clăti soneria mai complexă cu PBS pentru a reduce cantitatea de sare uscată pe țesutul liofilizat., După toate probele de țesut au fost prelucrate cu acest clătire finală pas și colectate în curat vas, vasul a fost înfășurat în lumina strans cu două straturi de 2.5 × 2.5 inch pătrat bucăți de folie de aluminiu, cu găuri mici, astfel încât întuneric-adaptat retina probe nu sunt expuse la lumină, și congelate rapid în N2 lichid. Găurile mici au permis accesul lichidului N2 în interior, umplând vasul petri și s-a avut grijă ca găurile să fie compensate astfel încât vasul petri să fie înfășurat etanș., Vasul petri a fost apoi plasat într-un balon Labconco de 600 mL folosind un liofilizator VirTis Benchtop 2 K (SP Scientific, SUA) timp de 30 min pentru a liofiliza țesutul.țesuturile retiniene liofilizate au fost depozitate la -80 °C într-un recipient umplut cu DrieriteTM (W. A. Hammond Drierite Co, SUA) sau au fost izolate ca +ros, +RIS și-ROS/Ris-țesut epuizat (-OIS), congelate din nou ca mai sus sau prelucrate pentru Western blots în aceeași zi. Toate procedurile de peeling au fost efectuate sub lumina camerei. Benzi mai mici decât 2.,Lățimea de 5 mm a fost tăiată și așezată pe marginea distribuitorului de bandă până când a fost tăiată în bucăți dreptunghiulare. O retină liofilizată fixată pe hârtia de filtru Whatman® a fost plasată într-un vas petri curat de 10 cm. O mică bucată dreptunghiulară de bandă ScotchTM (puțin mai mare decât suprafața țesutului) a fost tăiată și așezată cu grijă deasupra retinei liofilizate. Plasarea benzii deasupra retinei liofilizate a fost aproape suficientă pentru a atașa stratul ROS portocaliu pe bandă., Pentru a asigura contactul complet al ROS cu banda, a fost aplicată o ușoară presiune cu pensete pe partea superioară a benzii pentru a asigura contactul cu suprafața superioară. După îndepărtarea cu atenție a benzii, stratul ROS portocaliu a fost aderat la bandă și separat de restul retinei. Această fracțiune a fost etichetată +ROS și plasată într-un tub de microfuge curat. Adesea, un film subțire, alb, era vizibil la suprafața fracturată a stratului portocaliu de pe prima coajă de bandă., Această suprafață a fost îndepărtată cu mai multe coji de bandă până când a fost îndepărtată complet și culoarea portocalie a stratului ROS a fost adusă la suprafață. Acest strat alb atașat inițial la ROS a fost plasat într-un tub separat și etichetat +fracție RIS. Banda a fost utilizată pentru a îndepărta țesutul retinian rămas din hârtia de filtru și a fost plasată într-un tub etichetat-OIS., Valoarea presiunii aplicate la înregistrarea inițială coaja de portocala-colorate ROS strat afectate cum liofilizat de probă fracționată; prea multă presiune cauzate tot liofilizat retina să coaja de pe hârtie de filtru pe bandă și prea puțină presiune nu a separat partea de sus strat portocaliu de la nivelul retinei. Un cuplu de trece peste banda folosind o presiune minimă cu pensete a fost de ajutor în senzație în cantitatea minimă și maximă de presiune pentru a adăuga la partea de sus a benzii.,
pregătirea probei pentru Western blot: peeling cu hârtie de filtru
tuburile +ROS care conțin hârtiile de filtru au fost supuse unei centrifugări rapide într-o microcentrifugă timp de 2 s și excesul de lichid îndepărtat. Fiecare tub a fost prelucrat individual (o retină înjumătățită) sau două tuburi (două retine înjumătățite) au fost combinate pentru un material mai concentrat. Izolatul + ROS într–un singur tub a fost omogenizat în 45-60 µL de tampon tampon rece (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% deoxicolat de sodiu, 0,1% SDS, 1 mm EDTA, 0.,1 m PMSF, inhibitor complet de mini protează (Roche Applied Sciences)) și izolatul-ROS într-un singur tub a fost omogenizat în tampon RIPA 80-100 µL. Când au fost combinate două tuburi, 80-110 µL de tampon RIPA rece a fost utilizat pentru omogenizarea +ROS și 100-150 µL de tampon rece a fost utilizat pentru-ROS. Toate tuburile au fost omogenizate timp de 1 min cu un pistil autoclavat. S-a avut mare grijă ca bucățile de hârtie filtrantă din tuburile +ROS să fie ținute pe partea laterală a tuburilor și să rămână în contact cu pistilul în loc să fie blocate în partea de jos., După omogenizare, s-au folosit pensete sterile pentru a muta bucățile de hârtie de filtru în partea tubului +ROS, urmată de rotirea 2-4 s în microcentrifugă. Acest spin extras lichidul din hârtie, iar lichidul a fost transferat într-un tub curat și prelucrate pentru Western blot așa cum este descris mai jos. Acesta a fost pasul cel mai consumator de timp și, dacă nu este efectuat corect, o mare parte din eșantion poate ajunge să fie absorbit de bucățile de hârtie de filtru. Pentru a maximiza recuperarea probei, dimensiunea pieselor de hârtie de filtru utilizate pentru cojile ar trebui să fie tăiate pentru a se potrivi cu zona țesutului retinian.,
pregătirea probei: peeling cu bandă ScotchTM
Similar cu metoda de peeling a filtrului, două tuburi, fiecare conținând un strat decojit dintr-o jumătate de retină, au fost combinate pentru a crește concentrația de proteine. Probele +ROS și + Ris au fost omogenizate în 100-115 µL, iar probele-OIS în 125 µL de tampon RIPA rece. Toate tuburile au fost omogenizate timp de 1 min. S-a avut mare grijă ca banda din tuburile +ROS, +RIS și-OIS să rămână în contact cu pistilul și ca banda să fie ținută pe partea laterală a tuburilor în loc să fie blocată în partea de jos., După omogenizare, s-au folosit pensete sterile pentru a muta bucăți de bandă în partea laterală a tuburilor. Tuburile au fost filate în mini centrifugă timp de 2-4 s, după care bucățile uscate de bandă au fost îndepărtate cu grijă.
cuantificarea proteinelor, electroforeza în gel și imunobloturile proteice
un kit de testare a proteinelor BCA (Thermo Scientific, SUA) a fost utilizat pentru a determina cantitatea totală de proteine din fiecare probă. Două microlitri de DNaseI (10 unități/µL, Roche, Elveția) au fost adăugați la probe și au fost lăsați la temperatura camerei timp de 30 min., Volumul corespunzător de tampon de probă 4X SDS (40% glicerol, 240 mm Ph bază Tris 6,8, 8% SDS, 5% ßME, 0,04% Bromofenol albastru) a fost adăugat la omogenat.,tr>
Approximately 10 μg of protein lysate was loaded per lane and separated on a pre-cast polyacrylamide Bis-Tris gel with a 4–12% gradient (Life Technologies, USA) and transferred onto nitrocellulose membrane., Membranele au fost blocate în 10% lapte/TBS-T tampon pentru 1 h la temperatura camerei, și se incubează peste noapte cu următoarele anticorpi: iepure anti-ARR1 anticorp (1:1000, ref), mouse-ul anti-GNAT1 anticorp monoclonal (TF-15, 1:1000, CytoSignal), iepure anti-β-actina anticorp (1:5000, GeneTex Inc.), iepure anti-RGS9 anticorp (1:1000), iepure anti-Gß5L/S (CT215) (1:2000), și de iepure anti-citocrom C anticorpilor policlonali (1:500, Santa Cruz, sc-7159). Membranele au fost incubate cu anticorpi secundari marcați fluorescent (1: 10,000, Biosciences LI-COR) la RT timp de 1 oră., Benzile de proteine au fost detectate de sistemul de imagistică în infraroșu Odyssey® (LI-COR Biosciences, SUA), iar intensitatea fluorescenței benzilor individuale a fost cuantificată folosind ImageJ. GNAT1, ARR1 și RGS9 semnale au fost normalizate împotriva Gß5L pentru +ROS, +RIS probe, și împotriva actina pentru -ROS și -OIS probe. Pentru fiecare experiment independent, semnalele fluorescente pentru fiecare proteină din fiecare compartiment au fost, de asemenea, normalizate împotriva semnalelor combinate din toate compartimentele retiniene. Testele t nepereche cu 2 cozi au fost utilizate pentru a determina diferențele dintre două grupuri.