utveckling, differentiering och tillväxt av celler och vävnader kräver exakt reglerade mönster av genuttryck. Förstärkare arbetar som cis-reglerande element för att medla både rumslig och tidsmässig kontroll av utvecklingen genom att aktivera transkription i specifika celler och/eller undertrycka den i andra celler. Således, den särskilda kombinationen av transkriptionsfaktorer och andra DNA-bindande proteiner i en utvecklings vävnad kontrollerar vilka gener kommer att uttryckas i den vävnaden. Förstärkare tillåter att samma gen används i olika processer i rymden och tiden.,
identifiering och karakteriseringedit
traditionellt identifierades förstärkare med hjälp av en reportergen eller genom jämförande sekvensanalys och beräkningsgenomik. I genetiskt traktabla modeller som fruktflugan Drosophila melanogaster, till exempel, kan en reporter konstruktion som Lacz genen slumpmässigt integreras i genomet med hjälp av en P-element transposon. Om reportergenen integreras nära en förstärkare, kommer dess uttryck att återspegla uttrycksmönstret som drivs av den förstärkaren., Således tillåter färgning av flugorna för LacZ-uttryck eller aktivitet och kloning av sekvensen som omger integrationsplatsen identifiering av förstärkarsekvensen.
utvecklingen av genomisk och epigenomisk teknik har dock dramatiskt förändrat utsikterna för cis-regulatory modules (CRM) discovery., Nästa generations sekvensering (ngs) metoder möjliggör nu hög genomströmning funktionella CRM upptäcktsanalyser, och de kraftigt ökande mängder av tillgängliga data, inklusive storskaliga bibliotek av transkription factor-binding site (TFBS) motiv, samlingar av kommenterade, validerade CRMs, och omfattande epigenetiska data över många celltyper, gör korrekt beräknings CRM upptäckt ett uppnåeligt mål. Ett exempel på NGS-baserad strategi som kallas DNase-seq har möjliggjort identifiering av nukleosom-utarmat, eller öppna kromatin regioner, som kan innehålla CRM., Mer nyligen har tekniker som ATAC-seq utvecklats som kräver mindre utgångsmaterial. Nucelosom utarmade regioner kan identifieras in vivo genom uttryck av Dammetylas, vilket möjliggör större kontroll av celltyp specifik förstärkare identifiering.Beräkningsmetoder inkluderar jämförande genomik, klustring av kända eller förutspådda TF-bindande platser och övervakade maskininlärningsmetoder utbildade på kända CRMs., Alla dessa metoder har visat sig vara effektiva för CRM upptäckt, men var och en har sina egna överväganden och begränsningar, och var och en är föremål för ett större eller mindre antal falskt positiva identifications.In den jämförande genomik tillvägagångssätt, sekvens bevarande av icke-kodande regioner kan vara ett tecken på förstärkare. Sekvenser från flera arter är inriktade och bevarade regioner identifieras beräkningsmässigt., Identifierade sekvenser kan sedan fästas på en reportergen som grönt fluorescerande protein eller lacZ för att bestämma in vivo-mönstret av genuttryck som produceras av förstärkaren när det injiceras i ett embryo. mRNA uttryck av reportern kan visualiseras genom in situ hybridisering, vilket ger en mer direkt mått på förstärkaraktivitet, eftersom den inte utsätts för komplexiteten i översättning och proteinvikning., Även om mycket bevis har pekat på sekvensbevarande för kritiska utvecklingsförstärkare, har annat arbete visat att funktionen hos förstärkare kan bevaras med liten eller ingen primär sekvensbevarande. Till exempel har RET-förstärkarna hos människor mycket lite sekvensbevarande för dem i zebrafisk, men båda artens sekvenser producerar nästan identiska mönster av reportergenuttryck i zebrafisk., På samma sätt, i mycket divergerade insekter (åtskilda av cirka 350 miljoner år), befanns liknande genuttryck mönster av flera viktiga gener regleras genom liknande utgjorde CRMs även om dessa CRMs inte visar någon märkbar sekvens bevarande detekterbar genom standard sekvens inriktningsmetoder såsom BLAST.
i segmentering av insectsEdit
förstärkarna som bestämmer tidig segmentering i Drosophila melanogaster embryon är bland de bäst karaktäriserade utvecklingsförstärkare., I det tidiga flygembryot är gap-genen transkriptionsfaktorerna ansvariga för att aktivera och undertrycka ett antal segmenteringsgener, såsom parregelgenerna. Gapet gener uttrycks i block längs den främre-bakre axeln av flugan tillsammans med andra maternell effekt transkriptionsfaktorer, vilket skapar zoner inom vilka olika kombinationer av transkriptionsfaktorer uttrycks. Parregelgenerna separeras från varandra genom icke-Uttryckande celler. Dessutom kompenseras uttrycken för olika parregelgener av några celldiametrar från varandra., Således skapar unika kombinationer av parregelgenuttryck rumsliga domäner längs den främre bakre axeln för att ställa in var och en av de 14 enskilda segmenten. 480 bp-förstärkaren som ansvarar för att köra den skarpa remsan två av parregelgenen even-skipped (eve) har varit välkännetecknad. Förstärkaren innehåller 12 olika bindningsställen för moder-och klyftgentranskriptionsfaktorer. Aktivera och undertrycka platser överlappar varandra i följd., Eve uttrycks endast i en smal remsa av celler som innehåller höga koncentrationer av aktivatorerna och låg koncentration av undertryckarna för denna förstärkarsekvens. Andra förstärkare regioner kör eve uttryck i 6 andra ränder i embryot.
i vertebrate patterningEdit
att fastställa kroppsyxor är ett kritiskt steg i djurutvecklingen. Under mus embryonal utveckling, Nodal, en transformerande tillväxtfaktor-beta superfamily ligand, är en viktig gen som är involverad i mönstring både den främre-bakre axeln och den vänstra-högra axeln av det tidiga embryot., Nodalgenen innehåller två förstärkare: den proximala Epiblastförstärkaren (PEE) och den asymmetriska förstärkaren (ase). PEE är uppströms Nodalgenen och driver Nodal uttryck i den del av den primitiva strimma som kommer att differentiera in i noden (även kallad den primitiva noden). PEE slår på Nodalt uttryck som svar på en kombination av Wnt-signalering plus en andra, okänd signal; sålunda binder en medlem av lef/TCF-transkriptionsfaktorfamiljen sannolikt till en TCF-bindningsställe i cellerna i noden., Diffusion av Nodal bort från noden bildar en gradient som sedan Mönster den förlängda främre-bakre axeln av embryot. ASE är en intronic förstärkare som är bunden av gaffelhuvud domän transkriptionsfaktor Fox1. Tidigt i utvecklingen etablerar Fox1-driven Nodal expression den viscerala endodermen. Senare i utvecklingen, Fox1 bindning till ASE Driver Nodal uttryck på vänster sida av den laterala plattan mesoderm, vilket skapar vänster-höger asymmetri som är nödvändig för asymmetrisk organutveckling i mesoderm.,
etablering av tre bakterieskikt under gastrulation är ett annat kritiskt steg i djurutvecklingen. Var och en av de tre bakterieskikten har unika mönster av genuttryck som främjar deras differentiering och utveckling. Endodermen specificeras tidigt i utveckling av Gata4-uttryck, och Gata4 fortsätter till direkt tarmmorfogenes senare. Gata4 uttryck är kontrollerade i det tidiga embryot av en intronic förstärkare som binder en annan forkhead domän transkriptionsfaktor, FoxA2., Initialt förstärkaren Driver bred genuttryck i hela embryot, men uttrycket blir snabbt begränsad till endoderm, vilket tyder på att andra förtryckare kan vara inblandade i dess begränsning. Sen utveckling begränsar samma förstärkare uttryck för de vävnader som blir mage och bukspottkörtel. En ytterligare förstärkare är ansvarig för att upprätthålla Gata4-uttryck i endodermen under de mellanliggande stadierna av tarmutveckling.,
flera förstärkare främjar utvecklings robustnessEdit
vissa gener som är involverade i kritiska utvecklingsprocesser innehåller flera förstärkare av överlappande funktion. Sekundära förstärkare, eller” shadow enhancers”, kan hittas många kilobaser bort från den primära förstärkaren (”primär” hänvisar vanligtvis till den första förstärkaren upptäckt, som ofta är närmare den gen som den reglerar). På egen hand driver varje förstärkare nästan identiska mönster av genuttryck. Är de två förstärkarna verkligen överflödiga?, Det senaste arbetet har visat att flera förstärkare tillåter fruktflugor att överleva miljöstörningar, såsom en ökning av temperaturen. När den lyfts upp vid en förhöjd temperatur, misslyckas en enda förstärkare ibland att driva det fullständiga uttrycksmönstret, medan närvaron av båda förstärkarna tillåter normalt genuttryck.