Fetalt bovint Serum

fetalt bovint serum (FBS) är den flytande fraktionen av clotted blod från fetala kalvar, utarmat av celler, fibrin och koagulationsfaktorer, men innehåller ett stort antal näringsmässiga och makromolekylära faktorer som är väsentliga för celltillväxt. Bovint serumalbumin är den viktigaste komponenten I FBS. Tillväxtfaktorer I FBS är väsentliga för underhåll och tillväxt av odlade celler . FBS innehåller också en mängd små molekyler som aminosyror, sockerarter, lipider och hormoner.

FBS används i ett brett spektrum av applikationer., En av de främsta användningsområdena för FBS är i eukaryotisk cellkultur, med koncentraktioner upp till 20% eller ännu högre, där det ger många viktiga näringsämnen och tillväxtfaktorer som underlättar cellöverlevnad och proliferation. Det är dock viktigt att notera att FBS i mänskliga cellkulturer kan införa forskningsartefakter; mänskliga celler odlade med mänskliga sera beter sig annorlunda än de odlade med FBS ., FBS används också i forskning, tillverkning och kontroll av human-och veterinärvacciner och av bioteknikdroger, och används för att stoppa trypsin matsmältning eller för att fungera som protektant i kryopreservering . Cellkulturmedier utan serum har använts i många år. Fetalt bovint serum kanske inte är det bästa tillskottet för cellkultur. Till exempel förbättrar bovint serumalbumin med insulin-transferrin-natriumselenit och/eller epidermal tillväxtfaktor i odlingsmedium bovin embryokvalitet och trofoblastinvasion jämfört med fetalt bovint serum .

fetalt serum innehåller fler tillväxtfaktorer och har lägre gammaglobulin (dvs antikroppar) innehåll och icke-fetalt serum. Dessa är viktiga eftersom tillväxtfaktorerna underlättar cellöverlevnad och proliferation medan antikroppar kan binda till cellerna i kulturen. Dessutom innehåller fetalt serum lägre nivåer av komplementproteiner (komplement) än de från vuxna eller nyfödda. Dessa kompletteringar har oönskade effekter av lysingceller i kultur och stör immunoassays.

Serum och plasma härrör båda från helblod genom att använda centrifugering för att avlägsna komponenter inklusive röda blodkroppar. Skillnaden mellan plasma och serum är att koagulationsproteiner är närvarande i plasma men har avlägsnats från serum. Plasma framställs i allmänhet genom tillsats av antikoagulantia till blodet före centrifugering, men koagulationsproteinerna avlägsnas inte. Serum framställs genom att låta blodet koagulera före centrifugering eller genom omfattande/progressiv centrifugering. Fibrinogen och proteiner associerade med koagulering är således inte närvarande i serum.,

I människor, följande 22 proteiner består av 99% av den totala proteinhalten i serum och plasma: albumin, totalt IgG, transferrin, fibrinogen, totalt IgA -, alfa-2-macroglobulin, totalt IgM -, alfa-1-antitrypsin, C3 komplement, haptoglobulin, alfa-1-surt glykoprotein, apolipoprotein B, apolipoprotein A1, lipoprotein (a), faktor H, ceruloplasmin, C4 komplement komplement faktor B, pre-albumin, C9 komplement, C1q komplement, och C8 komplement . De återstående 1% innehåller hundratals proteiner., Det mest rikliga serumproteinet, albumin, vid 50 mg / ml, innefattar ungefär hälften av den totala proteinmassan .

International Serum Industry Association (Isia; www.serumindustry.org), en handelsorganisation av serumleverantörer, etablerade riktlinjer för kvalitetskontroll standardisering. Enligt dessa riktlinjer ska följande tester utföras med hjälp av särskilda metoder, och testresultaten ska vara tillgängliga som analyscertifikat (Tabell 1).,h>Test

bakterier och svampar – sterilitet testning

mykoplasma

cytopatiska medel – viral testning

hemadsorbing medel – viral testning

bovint virus diarré – viral testning

pH-mätning

osmolalitet

totalt protein, bestäms av den totala proteinhalten i blodet.biuret metod

endotoxin

hemoglobin

elektroforetiskt mönster

prestandatestning, såsom stamcellskultur

radiell immunodiffusion

immunoglobulin

gamma-glutamyltransferas (GGT)

endotoxiner, även kallade lipopolysackarid (LPS) eller lipooligosackarid (LOS), kommer från de yttre membranen av gramnegativa bakterier och bidrar till de kliniska manifestationerna av en mängd olika patogena gramnegativa bakterier. In vivo inducerar endotoxiner feber och det inflammatoriska svaret medan de i cellkultur introducerar variation i cellulära svar.

Endotoxinnivåerna mäts genom limulus amebocytelysat (LAL) – testet., Amebocyter är analoga med vita blodkroppar i ryggradsdjur och LAL framställs från blodet av Limulus polyphemus(American horseshoe crab; Figur 1). LAL är mycket känslig för endotoxiner och koagulerar i närvaro av jämn en minuts mängd endotoxin. Bevarandestatusen för den amerikanska hästskokrabben har bedömts och diskuterats i populärkulturen . Många av hästsko krabbor populationer är i riskzonen och därmed försiktighet bör vidtas för att skydda dem från förlust.

vi diskuterar några av vanligen använda specialitetssera nedan. Serumpreparat dedikerade till specifika forskningsämnen , såsom lipoproteinbristande serum från Kalen Biomedical för kolesterolforskning, eller för specialiserade genuttryck system , såsom tetracyklin-screened fetalt bovint serum, diskuteras inte.

vanliga FBS innehåller ett stort antal extracellulära vesiklar, av vilka några är exosomer ., När man utför exosomforskning med odlade celler är det kritiskt att använda FBS utan exosomer. Det är dock viktigt att vara medveten om att exosom-utarmat FBS kan påverka och stödja celltillväxt annorlunda än vanliga FBS . Exosom-utarmat FBS kan antingen köpas direkt från flera kommersiella leverantörer eller beredas genom antingen ultracentrifugation eller ultrafiltrering, även om effekterna av utarmningsprocesserna och/eller de kommersiella källorna kanske inte är konsekventa när det gäller celltillväxt och fysiologi .,

andra komponenter I FBS kan tömmas, beroende på experimentella krav. Till exempel, Galmozzi En et al utarmat heme från FBS med askorbinsyra .

en vanlig behandling av FBS är värmeinaktivering, där FBS upphettas vid 56°C i 30 minuter i ett vattenbad med tillfällig skakning. Syftet är att inaktivera vilka komponenter i komplementsystemet som finns i FBS och andra potentiella okända hämmare av celltillväxt., Tidigare värmeinaktivering var också avsedd att avlägsna mykoplasmaförorening, vilket inte längre är ett problem eftersom alla serumprodukter nu filtreras genom porstorlekar som är tillräckligt små för att avlägsna mykoplasma. Det måste noteras att värmeinaktivering kan ha oönskade effekter också, såsom att minska förmågan hos odlade celler att fästa på ytor .

flera leverantörer har uppmanat användare att inte värmeinaktivera FBS för de flesta cellkulturbehov., I varje fall är det lämpligt att utvärdera behovet av värmeinaktivering i en viss applikation, eftersom olika celler har olika svar mot värmeinaktivering av FBS .

dessutom, liksom alla andra protokoll med avseende på FBS, måste värmeinaktiveringsprocessen ske med försiktighet, eftersom en temperatur för hög eller långvarig uppvärmning kommer att inaktivera tillväxtfaktorer och generera fällningar.

HY Chew et al underhålls A431, HCC1569, MCF7, MDA-MB-231, MDA-MB-468, SCC25, SKBR3, T47D, RENCA och CT26.WT cellinjer i media med 10% (v/v) värmeinaktiverade FBS ., Freeman SA et al använde värmeinaktiverade FBS i hela sin studie om makrofager . Aikawa T et al odlade musen primära gliaceller på poly-D-lysin–belagda kolvar i DMEM som innehåller 10% värmeinaktiverade FBS från MilliporeSigma (F2442) . Feldman D et al odlade HEK293FT celler i DMEM kompletteras med värmeinaktiverade fetalt bovint serum från Seradigm (97068-085), och A549, HCT116, HT1080, A375 celler med värmeinaktiverade fetalt bovint serum från Sigma (F4135) för att utvärdera den optiska samman skärmar ., Kulkarni S et al underhålls Hut-78 celler med värmeinaktiverade fetalt bovint serum från Atlanta Biologiska substanser .

aktivt kol kan binda till lipofila molekyler och har sålunda använts för att avlägsna hormoner som androgen, östradiol, progesteron, kortisol, testosteron, trijodtyronin (T3) och tyroxin (T4) från FBS. Dessa serumlipidhormoner tenderar att störa immunoassay-system och insulinanalysmetoder. L Zhao et al uppmätt tumörcelltillväxt i odlingsmedia kompletterat med 10% kol-strippad serum ., dialys kan avlägsna alla molekyler med molekylvikt mindre än 10 000 MW från FBS. Detta inkluderar både polära och icke-polära molekyler. Hormoner, cytokiner, glukos, aminosyror och många andra avlägsnas. Dialys tar också bort antibiotika och andra exogena molekyler i FBS.

Dialyserade FBS från Thermo Fisher Scientific användes i kulturen av pankreasduktal adenokarcinom för silac mass spec studie och andra silac studier , och i kulturen av HeLa celler med Met analog l-aha pulsjakt för klick-Kemi detektering av långlivade proteiner .,

gammabestrålning kan vara en del av processen för att sterilisera FBS. FBS filtreras vanligen genom 0,1 um-filter flera gånger för att eliminera mikroorganismer. Gammabestrålning kan inaktivera de virus som vanligen förekommer hos nötkreatur. Vissa virusarter, såsom parvovirus, är emellertid resistenta mot gammabestrålning.

även om FBS har ett ganska lågt IgG-innehåll kan även denna nivå vara för hög för vissa program. IgG-nivån kan minskas avsevärt ytterligare genom att fånga kromatografi., FBS med låg IgG används för antikroppsproduktion, rekombinant proteinsyntes och andra applikationer.

Stamcellskultur har stränga krav när det gäller tillväxtfaktorer. Några av de tillväxtfaktorer som finns i FBS främjar stamcellsdifferentiering. Flera företag erbjuder embryonala stamceller kvalificerade FBS avsedda att upprätthålla odifferentierade stamceller. Det är dock viktigt att testa specifika partier av FBS för deras tillämplighet för att upprätthålla pluripotens/totipotens av olika typer av stamceller., Thermo Fisher ger embryonala stamceller kvalificerade FBS, som till exempel används i e14tg2a mus ES cellkultur av Yasuda s et al .

stora boskapsländer är de viktigaste leverantörerna av FBS. Länderna inkluderar USA, Australien, Nya Zeeland, Kanada, flera i södra och centrala Amerika.

produktion och insamling av serumprodukter regleras av myndigheter. FBS är märkt som USDA-Klass eller Europeisk Klass., USDA-klass FBS kan importeras till något land som är fritt från bovin spongiform encefalopati och mul-och klövsjuka, medan europeisk kvalitet FBS kan säljas i de flesta europeiska och asiatiska länder.

FBS lagras bäst fryst, mellan -5 till -20°C, och kan tinas vid en temperatur mellan 2 till 8°C. Det är ofta användbart att alikvot och frysa serumet i mindre portioner, ofta 50 ml rör, för att undvika många frysa och tina cykler. Ibland förblir vissa alikvoter av FBS i en vätska vid frystemperaturer., Detta beror på bristen på ett kärncentrum (partiklar) för att kristalliseringen (frysning) ska börja. Om du bara vrider rören med fingret stelnar de vanligtvis nästan omedelbart.

det är vanligt att ha viss fällning efter upptining. Utfällningarna, sannolikt på grund av denaturering av några av serumproteinerna, kan rensas genom Kort centrifugering, och detta påverkar i allmänhet inte serumets kvalitet.

många leverantörer ger FBS med olika kvaliteter, ursprungsland och behandling., FBS, i sig, är en komplex blandning, och variabilitet mellan olika kvaliteter, leverantörer och partier förväntas. Således är det viktigt att upprätta en process för att välja och utvärdera FBS. Det är en bra idé att undersöka litteraturen för att bestämma hur ett visst urval av FBS tidigare användes i liknande forskning, eller för samma cellkultur och att ägna stor uppmärksamhet åt potentiell lot-to-lot-variation i FBS. För att hjälpa till med detta har Labome genomfört en undersökning av FBS-användning från vetenskapliga publikationer, som diskuteras nedan, för att hjälpa våra besökare att välja de mest lämpliga FBS.,

labome undersökningar litteratur för de material som används. Här sammanfattas publikationerna som citerade Foster bovint serum. Publikationerna är en slumpmässig delmängd av över 10 000 publikationer.

Den stora leverantörer av FBS är Life Technologies (numera en del av Thermo Fisher Scientific), Thermo Fisher Scientific Hyclone (nu en del av GE LifeScience), och MilliporeSigma (Tabell 2).

Life Technologies är ett globalt bioteknikföretag med huvudkontor i Carlsbad, Kalifornien., Det är som bildades 2008 med sammanslagningen av Invitrogen Corporation och Applied Biosystems Inc. Många av produkterna under varumärket Gibco. De tillhandahåller cellodlingsprodukter, såsom cellodlingsmedium, FBS och andra relevanta reagenser. Företaget slogs samman med Thermo Fisher Scientific 2014.

FBS från Livet Teknik har använts för att studera nucleolus som en fas-separerade protein kvalitetskontroll enhet i HEK293T och HeLa celler ., Pandolfini L et al odlade HEK293T och A549 celler i DMEM kompletteras med 10% Gibco FBS (10270-106) och Caco-2 celler i Eagle ’ s Minimum Essential Medium kompletteras med 20% Gibco FBS (10270-106) . Hek293t-celler upprätthålls ganska ofta med 10% fetalt bovint serum från Thermo Fisher .

GE Healthcare Hyclone FBS används ofta. De Cecco M et al använde den på 15% för att upprätthålla senescent fibroblaster LF1, IMR-90 och WI-38 i Hams F-10 media ., Nicetto D et al används Hyclone FBS (SH30071) för att avsluta trypsin matsmältningen och upprätthålla embryonala celler . Laflamme C et al underhålls HEK-293 celler i DMEM hög glukos från GE Healthcare (SH30081.01) som innehåller 10% nöt kalv serum från GE Healthcare (SH30072.03) .

Frohner IE et al underhålls Neuro-2a (N2a) och Cos-7 celler från American Type Culture Collection i DMEM som innehåller 10% FBS från Bovogen, Frankrike . Laflamme C et al odlade U2OS celler i DMEM hög glukos som innehåller 10% tetracyclin-gratis fetalt bovint serum från Visent (081150) . Dong JX et al underhålls primära hippocampus kulturer på Matrigel från Corning med 5% fetalt bovint serum från Atlanta Biologiska substanser (S11550) ., Lee et al odlade murina C2C12 myoblasts med DMEM kompletteras med 10% fetalt bovint serum från VWR (89510-186) . Zhao N et al odlade U2OS celler från ATCC (HTB-96) i DMEM medium med 10% (v/v) fetalt bovint serum från Altas Biologiska substanser . Liu X et al odlade murina 4T1 celler i DMEMsupplemented med 10% fetalt bovint serum från Biochrom .