mikrobiologi (Svenska)

en mutation är en ärftlig förändring i DNA-sekvensen av en organism., Den resulterande organismen, som kallas en mutant, kan ha en igenkännlig förändring i fenotyp jämfört med den vilda typen, som är den fenotyp som oftast observeras i naturen. En förändring i DNA-sekvensen ges till mRNA genom transkription, och kan leda till en förändrad aminosyrasekvens i ett protein vid översättning. Eftersom proteiner utför de allra flesta cellulära funktioner kan en förändring i aminosyrasekvensen i ett protein leda till en förändrad fenotyp för cellen och organismen.,

effekter av mutationer på DNA-sekvensen

det finns flera typer av mutationer som klassificeras enligt hur DNA-molekylen förändras. En typ, kallad en punktmutation, påverkar en enda bas och uppträder oftast när en bas ersätts eller ersätts av en annan. Mutationer är också resultatet av tillägg av en eller flera baser, känd som en insättning, eller avlägsnande av en eller flera baser, känd som en radering.

effekter av mutationer på proteinstruktur och funktion

punktmutationer kan ha ett brett spektrum av effekter på proteinfunktionen (Figur 1). Som en följd av den genetiska kodens degenerering kommer en punktmutation vanligen att resultera i att samma aminosyra införlivas i den resulterande polypeptiden trots sekvensändringen. Denna förändring skulle inte ha någon effekt på proteinets struktur, och kallas således en tyst mutation. En missense-mutation resulterar i att en annan aminosyra införlivas i den resulterande polypeptiden., Effekten av en missense-mutation beror på hur kemiskt annorlunda den nya aminosyran är från den vilda aminosyran. Placeringen av den förändrade aminosyran inom proteinet är också viktig. Till exempel, om den förändrade aminosyran är en del av enzymets aktiva plats, kan effekten av missense-mutationen vara signifikant. Många missense mutationer resulterar i proteiner som fortfarande är funktionella, åtminstone till viss del. Ibland effekterna av missense mutationer kan vara skenbara under vissa miljöförhållanden. sådana missense mutationer kallas villkorlig mutationer., Sällan kan en missense-mutation vara till nytta. Under de rätta miljöförhållandena kan denna typ av mutation ge den organism som hyser den en selektiv fördel. Men en annan typ av punktmutation, kallad en nonsensmutation, omvandlar en kodon som kodar för en aminosyra (en sense codon) till en stoppkodon (en nonsens codon). Nonsens mutationer resulterar i syntesen av proteiner som är kortare än den vilda typen och vanligtvis inte funktionell.

deletioner och Infogningar orsakar också olika effekter., Eftersom kodon är tripletter av nukleotider, kan Infogningar eller deletioner i grupper om tre nukleotider leda till införande eller radering av en eller flera aminosyror och kan inte orsaka signifikanta effekter på det resulterande proteinets funktionalitet. Frameshiftmutationer, orsakade av Infogningar eller raderingar av ett antal nukleotider som inte är en multipel av tre, är emellertid extremt problematiska eftersom en förskjutning i läsramens resultat (Figur 1). Eftersom ribosomer läser mRNA i triplettkodon kan frameshiftmutationer ändra varje aminosyra efter mutationspunkten., Den nya läsramen kan också innehålla en stoppkodon före slutet av kodningssekvensen. Följaktligen är proteiner gjorda av gener som innehåller frameshiftmutationer nästan alltid icke-funktionella.

Figur 1. Klicka för en större bild. Mutationer kan leda till förändringar i proteinsekvensen kodad av DNA.

en fördelaktig Mutation

sedan det första fallet av infektion med humant immunbristvirus (HIV) rapporterades 1981, har nästan 40 miljoner människor dött av HIV-infektion, det virus som orsakar förvärvat immunbristsyndrom (AIDS)., Viruset riktar helper T-celler som spelar en nyckelroll för att överbrygga det medfödda och adaptiva immunsvaret, infektera och döda celler som normalt är involverade i kroppens svar på infektion. Det finns inget botemedel mot HIV-infektion, men många droger har utvecklats för att sakta eller blockera virusets progression. Även om individer runt om i världen kan vara smittade, är den högsta prevalensen bland människor 15-49 år gammal i Afrika söder om Sahara, där nästan en person i 20 är smittad och står för mer än 70% av infektionerna över hela världen (Figur 2)., Tyvärr är detta också en del av världen där förebyggande strategier och läkemedel för att behandla infektionen är mest saknas.

Figur 2. HIV är mycket vanligt i Afrika söder om Sahara, men dess prevalens är ganska låg i vissa andra delar av världen.

under de senaste åren har vetenskapligt intresse blivit piqued av upptäckten av några individer från norra Europa som är resistenta mot HIV-infektion. 1998, amerikansk genetiker Stephen J., O ’ Brien vid National Institutes of Health (NIH) och kollegor publicerade resultaten av deras genetiska analys av mer än 4000 individer. Dessa indikerade att många individer av eurasisk härkomst (upp till 14% i vissa etniska grupper) har en deletionsmutation, kallad CCR5-delta 32, i genen som kodar för CCR5. CCR5 är en coreceptor som finns på ytan av T-celler som är nödvändig för många stammar av viruset att komma in i värdcellen. Mutationen leder till produktion av en receptor till vilken HIV inte effektivt kan binda och därmed blockerar viral inträde., Människor homozygot för denna mutation har kraftigt minskad känslighet för HIV-infektion, och de som är heterozygot har också ett visst skydd mot infektion.

det är inte klart varför människor med nordeuropeisk härkomst, specifikt, bär denna mutation, men dess prevalens verkar vara högst i norra Europa och minskar stadigt i populationer när man rör sig söderut. Forskning tyder på att mutationen har funnits sedan innan HIV dök upp och kan ha valts ut för i europeiska populationer som ett resultat av exponering för pesten eller smittkoppor., Denna mutation kan skydda individer från pest (orsakad av bakterien Yersinia pestis) och smittkoppor (orsakad av variola-viruset) eftersom denna receptor också kan vara involverad i dessa sjukdomar. Denna mutations ålder är en fråga om debatt, men uppskattningar tyder på att den uppträdde mellan 1875 år till 225 år sedan och kan ha spridits från norra Europa genom Vikingainvasioner.

detta spännande fynd har lett till nya vägar inom HIV-forskning, inklusive att leta efter droger för att blockera CCR5-bindning till HIV hos individer som saknar mutationen., Även om DNA-testning för att bestämma vilka individer som bär CCR5-delta 32-mutationen är möjlig, finns det dokumenterade fall av individer homozygot för mutationen som smittar HIV. Av denna anledning rekommenderas DNA-testning för mutationen inte allmänt av folkhälsopersonal för att inte uppmuntra riskabelt beteende hos dem som bär mutationen. Att hämma bindningen av HIV till CCR5 fortsätter dock att vara en giltig strategi för utveckling av läkemedelsbehandlingar för HIV-infekterade.,

orsaker till mutationer

misstag i processen för DNA-replikering kan orsaka spontana mutationer att inträffa. Felfrekvensen för DNA-polymeras är en felaktig bas per miljard baspar replikeras. Exponering för mutagener kan orsaka inducerade mutationer, vilka är olika typer av kemiska medel eller strålning (Tabell 1). Exponering för en mutagen kan öka mutationshastigheten mer än 1000 gånger. Mutagener är ofta också cancerframkallande ämnen, medel som orsakar cancer. Men medan nästan alla cancerframkallande ämnen är Mutagena är inte alla mutagener nödvändigtvis cancerframkallande.,

kemiska mutagener

olika typer av kemiska mutagener interagerar direkt med DNA antingen genom att fungera som nukleosidanaloger eller genom att ändra nukleotidbaser., Kemikalier som kallas nukleosidanaloger liknar strukturellt normala nukleotidbaser och kan införlivas i DNA under replikation (Figur 3). Dessa basanaloger inducerar mutationer eftersom de ofta har olika basparningsregler än de baser de ersätter. Andra kemiska mutagener kan ändra normala DNA-baser, vilket resulterar i olika basparningsregler. Till exempel deaminerar salpetersyra cytosin, omvandlar den till uracil. Uracil parar sedan med adenin i en efterföljande replikeringsrunda, vilket resulterar i omvandling av ett GC-baspar till ett at-baspar., Salpetersyra deaminerar också adenin till hypoxantin, vilken baspar med cytosin istället för tymin, vilket resulterar i omvandling av ett ta-baspar till ett kg-baspar.

Figur 3. Klicka för en större bild. a) 2-aminopurinnukleosid (2AP) är strukturellt en nukleosidanalog till adeninnukleosid, medan 5-bromouracil (5BU) är en nukleosidanalog till tyminnukleosid. 2AP baspar med C, konvertera en AT baspar till en GC baspar efter flera omgångar av replikering., 5BU par med G, konvertera en AT baspar till en GC baspar efter flera omgångar av replikering. B) salpetersyra är en annan typ av kemisk mutagen som modifierar redan befintliga nukleosidbaser som C för att producera U, vilken baspar med A. Denna kemiska modifiering, som visas här, resulterar i att omvandla ett CG-baspar till ett TA-baspar.

kemiska mutagener som kallas interkalaterande medel fungerar annorlunda., Dessa molekyler glider mellan de staplade kvävebaserna av DNA – dubbelhelixen, förvränger molekylen och skapar atypisk avstånd mellan nukleotidbaspar (Figur 4). Som ett resultat kan DNA-polymeras under DNA-replikering antingen hoppa över replikering av flera nukleotider (skapa en radering) eller infoga extra nukleotider (skapa en insättning). Antingen resultatet kan leda till en frameshift mutation. Förbränningsprodukter som polycykliska aromatiska kolväten är särskilt farliga interkalaterande medel som kan leda till mutation orsakad cancer., De interkalaterande agenterna ethidiumbromid och akridin orange används ofta i laboratoriet för att fläcka DNA för visualisering och är potentiella mutagener.

Figur 4. Interkalaterande medel, såsom akridin, introducerar atypiskt avstånd mellan baspar, vilket resulterar i DNA-polymeras som introducerar antingen en radering eller en insättning, vilket leder till en potentiell frameshiftmutation.

strålning

exponering för antingen joniserande eller noniserande strålning kan var och en inducera mutationer i DNA, även om olika mekanismer., Stark joniserande strålning som röntgenstrålar och gammastrålar kan orsaka enkel – och dubbelsträngade raster i DNA-ryggraden genom bildandet av hydroxylradikaler vid strålningsexponering (Figur 5). Joniserande strålning kan också modifiera baser; till exempel deaminering av cytosin till uracil, analog med verkan av salpetersyra. Joniserande strålningsexponering används för att döda mikrober för att sterilisera medicintekniska produkter och livsmedel, på grund av dess dramatiska icke-specifika effekt vid skada DNA, proteiner och andra cellulära komponenter (Se använda fysiska metoder för att kontrollera mikroorganismer).,

Nonioniserande strålning, som ultraviolett ljus, är inte tillräckligt energisk för att initiera dessa typer av kemiska förändringar. Nonioniserande strålning kan emellertid inducera dimerbildning mellan två intilliggande pyrimidinbaser, vanligen två tyminer, inom en nukleotidsträng. Under tymindimerbildning blir de två intilliggande tyminerna kovalent länkade och om de lämnas oreparerade, stannar både DNA-replikation och transkription vid denna tidpunkt. DNA-polymeras kan fortsätta och replikera dimer felaktigt, vilket potentiellt leder till frameshift eller punktmutationer.,

Figur 5. a) joniserande strålning kan leda till bildning av enkelsträngade och dubbelsträngade raster i DNA: s sockerfosfat-ryggrad samt till modifiering av baser (ej angivna). (B) Nonioniserande strålning som ultraviolett ljus kan leda till bildandet av tymindimerer, som kan stalla replikering och transkription och införa frameshift eller punktmutationer.

DNA-reparation

processen för DNA-replikering är mycket noggrann, men misstag kan uppstå spontant eller induceras av mutagener. Okorrigerade misstag kan leda till allvarliga konsekvenser för fenotypen. Celler har utvecklat flera reparationsmekanismer för att minimera antalet mutationer som kvarstår.,

korrekturläsning

de flesta av de misstag som införts under DNA-replikering korrigeras snabbt av de flesta DNA-polymeraser genom en funktion som kallas korrekturläsning. I korrekturläsning läser DNA-polymerasen den nytillkomna basen, vilket säkerställer att den kompletterar motsvarande bas i mallsträngen innan du lägger till nästa. Om en felaktig bas har tillsatts, gör enzymet ett snitt för att frigöra fel nukleotid och en ny bas tillsätts.,

felmatchning reparation

vissa fel som införts under replikering korrigeras strax efter replikering maskiner har flyttat. Denna mekanism kallas mismatch reparation. De enzymer som är involverade i denna mekanism känner igen den felaktigt tillsatta nukleotiden, punktdelar den och ersätter den med rätt bas. Ett exempel är methyl-directed mismatch repair i E. coli. DNA är hemimethylated. Detta innebär att föräldrasträngen är metylerad medan den nyligen syntetiserade dottersträngen inte är. Det tar flera minuter innan den nya strängen är metylerad., Proteiner mutar, MutL och MutH binder till den hemimetylerade platsen där den felaktiga nukleotiden finns. MutH skär den icke-metylerade strängen (den nya strängen). En exonukleas avlägsnar en del av strängen (inklusive den felaktiga nukleotiden). Gapet som bildas fylls sedan in av DNA pol III och ligas.

reparation av Tymindimerer

eftersom produktionen av tymindimerer är vanligt (många organismer kan inte undvika ultraviolett ljus) har mekanismer utvecklats för att reparera dessa skador., I nukleotid excision reparation (även kallad mörk reparation), enzymer avlägsna pyrimidin dimer och ersätta den med rätt nukleotider (Figur 6). I E. coli skannas DNA av ett enzymkomplex. Om en distorsion i dubbelhelixen upptäcks som introducerades av pyrimidindimer, skär enzymkomplexet sockerfosfatbacken flera baser uppströms och nedströms dimer, och segmentet av DNA mellan dessa två skärningar avlägsnas sedan enzymatiskt. DNA pol i ersätter de saknade nukleotiderna med de rätta och DNA-ligas förseglar gapet i sockerfosfatbacken.,

den direkta reparationen (även kallad ljusreparation) av tymindimerer sker genom fotoreaktiveringsprocessen i närvaro av synligt ljus. Ett enzym som kallas fotolyas känner igen förvrängningen i DNA-helixen som orsakas av tymindimeren och binder till dimer. Sedan, i närvaro av synligt ljus, ändrar fotolyasenzymet konformation och bryter ihop tymindimeren, vilket gör att tyminerna återigen kan basera par med adeninerna på den kompletterande strängen., Fotoreaktivering verkar förekomma i alla organismer, med undantag av placenta däggdjur, inklusive människor. Fotoreaktivering är särskilt viktigt för organismer som kroniskt utsätts för ultraviolett strålning, som växter, fotosyntetiska bakterier, alger och koraller, för att förhindra ackumulering av mutationer orsakade av tymindimerbildning.

Figur 6. Klicka för en större bild. Bakterier har två mekanismer för att reparera tymindimerer., (a) i nukleotid excision reparation, en enzymkomplex känner igen distorsion i DNA-komplexet runt tymin dimer och skär och tar bort den skadade DNA-strängen. De korrekta nukleotiderna ersätts av DNA pol i och nukleotidsträngen förseglas med DNA-ligas. b) i fotoreaktivering binder enzymet fotolyas till tymindimeren och, i närvaro av synligt ljus, bryter sönder dimeren och återställer basparningen av tyminerna med kompletterande adeniner på motsatt DNA-sträng.,

identifiera bakteriella mutanter

en vanlig teknik som används för att identifiera bakteriella mutanter kallas replikplätering., Denna teknik används för att detektera näringsmutanter, kallade auxotrofer, som har en mutation i en gen som kodar för ett enzym i biosyntesens väg för ett specifikt näringsämne, såsom en aminosyra. Som ett resultat, medan vilda celler behåller förmågan att växa normalt på ett medium som saknar det specifika näringsämnet, kan auxotrophs inte växa på ett sådant medium. Under replikplätering (Figur 7) mutageniseras en population av bakterieceller och pläteras sedan som enskilda celler på en komplex näringsmässigt komplett platta och får växa till kolonier., Celler från dessa kolonier avlägsnas från denna huvudplatta, ofta med steril sammet. Denna sammet, innehållande celler, pressas sedan i samma orientering på plattor av olika medier. Minst en platta bör också vara näringsmässigt komplett för att säkerställa att cellerna överförs korrekt mellan plattorna. De andra plattorna saknar specifika näringsämnen, så att forskaren kan upptäcka olika auxotrofa mutanter som inte kan producera specifika näringsämnen. Celler från motsvarande koloni på den näringsmässigt kompletta plattan kan användas för att återställa mutanten för vidare studier.,

Figur 7. Identifiering av auxotrofa mutanter, som histidin auxotrophs, görs med replikplätering. Efter mutagenes identifieras kolonier som växer på näringsmässigt komplett medium men inte på medium som saknar histidin som histidin auxotrophs.

Ames– testet

Ames-testet, utvecklat av Bruce Ames (1928 -) på 1970-talet, är en metod som använder bakterier för snabb, billig screening av den cancerframkallande potentialen hos nya kemiska föreningar. Testet mäter mutationshastigheten associerad med exponering för föreningen, som, om den är förhöjd, kan indikera att exponering för denna förening är förknippad med större cancerrisk., Ames-testet använder som testorganismen en stam av Salmonella typhimurium som är en histidin auxotroph, som inte kan syntetisera sin egen histidin på grund av en mutation i en väsentlig gen som krävs för dess syntes. Efter exponering för en potentiell mutagen, dessa bakterier är pläterade på ett medium som saknar histidin, och antalet mutanter återfå förmågan att syntetisera histidin registreras och jämfört med antalet sådana mutanter som uppstår i frånvaro av den potentiella mutagen (figur 8)., Kemikalier som är mer Mutagena kommer att medföra fler mutanter med återställd histidinsyntes i Ames-testet. Eftersom många kemikalier inte är direkt Mutagena men metaboliseras till Mutagena former av leverenzymer, ingår råttleverextrakt vanligen i början av detta experiment för att efterlikna levermetabolism. Efter att Ames-testet utförts testas föreningar som identifierats som Mutagena ytterligare för deras potentiella cancerframkallande egenskaper med hjälp av andra modeller, inklusive djurmodeller som möss och råttor.

figur 8., Ames-testet används för att identifiera Mutagena, potentiellt cancerframkallande kemikalier. En Salmonella histidin auxotroph används som teststam, utsatt för en potentiell mutagen / carcinogen. Antalet reversion-mutanter som kan växa i frånvaro av levererat histidin räknas och jämförs med antalet naturliga Reversion-mutanter som uppstår i frånvaro av den potentiella mutagen.